همسانه سازی و بیان هترولوگ ژن کد کننده زیر واحد کاتالیزگر آنزیم استوهیدروکسی اسید سنتاز از گیاه برنج (Oryza Sativa) در باکتری Escherichia coli

SUPERVISOR
آذر شاه پیری (استاد راهنما) علی اصغر کارخانه (استاد مشاور)
 
STUDENT
Ghazaleh Arabzadeh
غزاله عرب زاده

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1393

TITLE

Cloning and Heterologous Expression of Catalytic Subunit of Rice (Oryza Sativa) Acetohydroxy Acid Synthase in Escherichia coli
Acetohydroxyacid synthase (AHAS, EC 2.2.1.6) is the first enzyme in the biosynthetic pathway of the branched chain amino acids. The function of AHAS is to catalyze the condensation of two molecules of pyruvate to form acetolactate (the precursor of valine and leucine) or one molecule of pyruvate with a molecule of 2-ketobutyrate to generate 2-aceto-2-hydroxybutyrate (the precursor of isoleucine). AHAS is the target enzyme for several Keywords : Acetohydroxy Acid Synthase, Oryza Sativa , branched-chain amino acids, sulfonylurea herbicides
آنزیم استوهیدروکسی اسید سنتاز (EC 2.2.1.6) اولین مرحله در مسیر بیوسنتز اسید آمینه‌های شاخه دار را کاتالیز می‌کند. این آنزیم با اتصال دو مولکول پیروات استولاکتات را می‌سازد که پیش ساز دو اسیدآمینه‌ی والین و لوسین می‌باشد. هم‌چنین با اتصال یک مولکول پیروات و یک مولکول2-کتو بوتیرات، منجر به تولید 2- استو2- هیدروکسی بوتیرات می‌شود که پیش ساز اسیدآمینه‌ی ایزولوسین می‌باشد. این آنزیم مورد هدف علف کش‌های بازدارنده AHAS از جمله سولفونیل اوره‌ها قرار می‌گیرد که فعالیت آنزیم را مهار می‌کنند. آنزیم کامل AHAS شامل زیر واحد کاتالیزگر و زیرواحد تنظیمی می‌باشد. در این مطالعه ژن کدکننده زیرواحد کاتالیزگر آنزیم AHAS از گیاه برنج ( Oryza Sativa ) با یک قسمت کوتاه از توالی ترانزیت پپتید کلروپلاستی در پلاسمید pET41a همسانه سازی شد. پلاسمید نوترکیب حاصل به میزبان بیانی Escherichia coli سویهRosetta (DE3) منتقل و بیان GST-OsAHAS با افزودن IPTG القا شد. به منظور افزایش حلالیت پروتئین نوترکیب در سیستم بیانی پروکاریوتی برخی از شرایط بیانی رشد باکتری بهینه شدند. پروتئین نوترکیب با روش کروماتوگرافی تمایلی و با استفاده از ستون‌هایtrap HP His- خالص سازی گردید. فعالیت آنزیمی پروتئین نوترکیب خالص شده در حضور پیش ماده و کوفاکتورهای مورد نیاز خود با روش رنگ سنجی اندازه گیری و سپس تمامی اجزا و شرایط واکنش برای فعالیت حداکثری آنزیم بهینه شدند. فعالیت آنزیمی به صورت جداگانه در حضور سه اسید آمینه شاخه دار و هم‌چنین در حضور 5 علف کش مهار کننده AHAS از خانواده سولفونیل اوره‌ها مورد سنجش قرار گرفت. پروتئین خالص به صورت یک باند با سایزی در حدود 98 کیلو دالتون بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده شد که وزن مولکولی پیش بینی شده برای پروتئین نوترکیب را تایید می‌کند. غلظت پروتئین نوترکیب تحت شرایط آزمایش شده که شامل غلظت 1/0 میلی مولار القاکننده، استفاده از محیط کشت TB، کاهش دمای رشد باکتری تا ° C28و افزایش زمان بیان تا 6 ساعت بود به صورت موفقیت آمیزی تا مقدار 726 میکروگرم بر میلی لیتر افزایش یافت. غلظت‌های بهینه در واکنش آنزیمی AHAS برای پیش ماده، ThDP، FAD و MgCl 2 برابر با 50 میلی مولار، 2 میلی مولار، 10 میکرومولار و 10 میلی مولار بدست آمد. هم‌چنین آنزیم در دمای ° C37 و در pH برابر 8 بالاترین میزان فعالیت را داشت. با در نظرگرفتن تمامی شرایط بهینه، فعالیت آنزیم برابر با ?mol/min.mg 065/0 اندازه گیری شد. این فعالیت آنزیمی در حضور سه اسیدآمینه‌ی والین، لوسین و ایزولوسین به طور متوسط تا 10% کاهش یافت؛ که مهم ترین علت آن را می‌توان به نبود زیرواحد تنظیمی برای ایفای نقش خود در بازخورد مهاری مرتبط دانست. نتایج ارزیابی فعالیت آنزیم در حضور علف کش‌ها نشان داد که مقدار I 50 برای علف کش‌های تری بنورون، سولفوسولفورن، نیکو سولفورن و بن سولفورن به ترتیب برابر با 50، 60، 50و 120 نانومولار بود. هم‌چنین علف کش ریم سولفورن واکنش آنزیمی را مهار نکرد. طبق نتایج این تحقیق، علف کش بن سولفورن با بالاترین غلظت در مهار AHAS گیاه برنج می‌تواند به عنوان علف کشی با کمترین تاثیر بر روی AHAS گیاه برنج برای از بین بردن علف‌های هرز این گیاه زراعی قابل توصیه باشد. این علف کش در شرایط طبیعی مزرعه نیز به عنوان یکی از علف کش‌های مورد استفاده در مزارع برنج شناخته می‌شود که می‌تواند تاییدی بر نتایج این تحقیق باشد. کلمات کلیدی : استوهیدروکسی اسید سنتاز، Oryza Sativa ، اسیدآمینه‌های شاخه دار، علف کش‌های مهار کننده AHAS

ارتقاء امنیت وب با وف بومی