همانه سازی و بیان هترولوگ ژن کد کننده زیر واحد تنظیم کننده آنزیم استوهیدروکسی اسید سنتاز از گیاه برنج (Oryza Sativa) در باکتری Escherichia coli

SUPERVISOR
Azar Shahpiri
آذر شاه پیری (استاد راهنما)
 
STUDENT
Fatemeh Sedighian
فاطمه صدیقیان

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1394

TITLE

Cloning and Heterologous Expression of Regylatory Subunit of Rice (Oryza Sativa) Acetohydroxy Acid Synthase in Escherichia coli
Acetohydroxyacid synthase (AHAS, EC 2.2.1.6) catalyzes the initial step in the formation of the branched-chain amino acids. The function of AHAS is to catalyze the condensation of two molecules of pyruvate to form acetolactate (the precursor of valine and leucin) or one molecule of pyruvate with a molecule of 2-ketobutyrate to generate 2-aceto-2-hydroxybutyrate (the precursor of isoleucine). AHAS is the target enzyme for several Keywords: Acetohydroxy Acid Synthase, Regulatory subunit, Catalytic subunit, Branched chain amino acids
آنزیم استوهیدروکسی اسید سینتاز (AHAS: EC 2.2.1.6) اولین مرحله از مسیر بیوسنتز آمینواسیدهای شاخه‌دار را سنتز می‌کند. این آنزیم با اتصال دو مولکول پیروات، استولاکتات را می‌سازد که پیش ساز دو آمینواسید والین و لوسین می‌باشد. همچنین با اتصال یک مولکول پیروات و یک مولکول 2-کتوبوتیرات، منجر به تولید 2- استو 2- هیدروکسی بوتیرات می‌شود که پیش ساز آمینواسید ایزولوسین می‌باشد. آنزیم استوهیدروکسی اسید سینتاز مورد هدف علف کش‌های بازدارنده AHAS از جمله سولفونیل اوره‌ها و ایمیدازولینون می‌باشد که فعالیت آنزیم را مهار می‌کنند. آنزیم کامل AHAS شامل دو نوع زیرواحد کاتالیزگر و تنظیم کننده می‌باشد که زیرواحد کاتالیزگر به تنهایی فعالیت کمی دارد و به ThDP وابسته است و زیرواحد تنظیمی به تنهایی فعالیت ندارد اما موجب افزایش فعالیت آنزیم و بازخورد مهاری آن نسبت به آمینواسیدها می‌شود. در این مطالعه ژن کد کننده زیرواحد تنظیمی آنزیم AHAS از گیاه برنج ( Oryza Sativa ) در pET28a همسانه سازی شد. پلاسمید نوترکیب به میزبان بیانی Escherichia coli سویه Rosetta (DE3) منتقل و بیان His-AHAS با افزودن IPTG القا شد. مقدار زیادی از پروتئین نوترکیب تولید شده در فاز نامحلول قرار داشت و برای حل این مشکل از دنباله GST استفاده گردید. به این ترتیب که از پلاسمید pET41a برای همسانه سازی استفاده شد. پس از بیان پروتئین GST-AHAS، با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی فاز محلول پروتئین نوترکیب خالص‌سازی شد. پروتئین خالص سازی شده یک باند با سایزی در حدود 9/67 کیلودالتون بر روی SDS-PAGE نشان داد که وزن مولکولی پیش بینی شده برای پروتئین نوترکیب را تایید می کند. به منظور بررسی فعالیت آنزیمی، زیرواحد کاتالیزگر نیز که در مطالعات قبلی همانندسازی شده بود، بیان و خالص‌سازی گردید. سپس فعالیت آنزیمی AHAS در حضور و عدم حضور زیرواحد تنظیمی در غلظت های 50 تا 250 نانومولار زیرواحد تنظیم کننده در حضور پیش ماده و کوفاکتورهای مورد نیاز با روش رنگ سنجی سنجیده شد. حضور زیرواحد تنظیم کننده موجب افزایش فعالیت آنزیم تا سه برابر شد. فعالیت آنزیم در حضور سه آمینواسید شاخه‌دار والین، لوسین و ایزولوسین و با حضور و عدم حضور زیرواحد تنظیمی سنجیده شد. نتایج نشان داد حضور زیرواحد تنظیمی موجب بازخورد مهاری آنزیم توسط سه آمینواسید شاخه‌دار می‌شود. به طوریکه فعالیت ویژه در حضور لوسین 51%،والین 44% و ایزولوسین 30% کاهش یافت. کلمات کلیدی: استوهیدروکسی اسید سینتاز، زیرواحد تنظیمی، زیرواحد کاتالیزگر و آمینواسیدهای شاخه دار

ارتقاء امنیت وب با وف بومی