Skip to main content
SUPERVISOR
Amir Massah
امیر مساح (استاد راهنما)
 
STUDENT
Saeed Foroughi
سعید فروغی

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1396

TITLE

Detection and identification of endosymbionts of Toya propinqua and their effects on transmission of cynodon chlorotic streak virus
The interactions between the host and associated microorganisms could affect the host. One of the emerging studies in this field is the effects of symbiotic bacteria on insect vectors and the transmission of plant viruses. For this purpose,Toya propinquawas collected from weed around the fields, mostly bermudagrass in Isfahan, Mobarakeh, Zarrinshahr and Golpayegan. After a preliminary study of morphological characteristics, the collected planthoppers were released into the aluminum boxes containing bermudagrass for propagation. Morphological characteristics of the body, the male genitalia, and the cytochrome oxidase gene sequence confirmed the collected planthoppers aToya propinqua. To identify culturable bacterial symbionts ofToya propinqua, the body suspension of planthoppers was cultured on NA medium. The colonies were subcultured, and DNA was extracted from purified colonies. PCR was performed using 27F/1492R primer pair. Sequencing of amplified bands and BLAST search led to identifying two bacteria,aenibacillu. andAcinetobacter. In order to identify non-culturable prokaryotic symbionts, extracted DNA of planthoppers was subjected to PCR using specific primers ofWolbachia. (81F/691R),Cardinium. (CLOF/CLOR1),Rickettsia. (RBF/RBR), andiroplasma. (Spi-f1/Spi-r3). Sequencing the amplified segments and BLAST search revealed the association ofWolbachia.,Cardinium.,Rickettsia.,Cardiobacter. andiroplasma. withT. propinqua. According to our information, exceptingWolbachia, other symbionts are reported fromT. propinquafor the first time. Sequencing the amplicon and BLAST search showed the presence of YLS iT. propinqua.For determining the frequency ofWolbachia,Cardinium, andRickettsiaymbionts iT. propinquaopulations, planthoppers were collected from Isfahan, Golpayegan, Zarrinshahr, and Mobarakeh and were tested by PCR. In total,Wolbachia.,Cardinium. andRickettsia. were found in 75% of the planthoppers. About 94.4% of males and 59.1% of females showed to have symbionts. The frequency ofWolbachia.was 72.5%,Cardinium.45%, andRickettsia.42.5%. Single infection ofWolbachia.was calculated in 15%,Wolbachia.+Cardinium.in 17%, andWolbachia.+Rickettsia.in 15%, and three symbionts were in 25% of the planthoppers. In general, the presence ofWolbachia.was estimated at 82.3%, andRickettsia. at 73.4%, double infection ofWolbachia. +Rickettsia. was estimated at 70%, and 8.9% of the planthoppers lackedWolbachia. andRickettsia. The transmission efficiency of cynodon chlorotic streak virus (CCSV) byT. propinquafrom bermudagrass to oat plants was calculated 54.21%. To determine the effect ofWolbachia. andRickettsia. on the transmission efficiency of CCSV byT. propinqua, the planthoppers were examined in the transmission test. The planthoppers were first placed on infected bermudagrasses for three days and then maintained on healthy bermudagrasses for one month. By the end of the incubation period, the planthoppers were placed individually on the oat plants in the coleoptile stage. The planthoppers were transferred into the -80 °C freezer after three days. Total RNA was extracted from plant leaves one month after transmission feeding and analyzed by RT-PCR with CCSVIrF/CCSVIrR primer pair. Total DNA was extracted from the planthoppers, and theymbionts were detected using specific primers. Data analysis using the t-test showed the effect ofWolbachia. andRickettsia. in decreasing and increasing CCSV transmission efficiency byT. propinqua, respectively. The focus of future researches on the four plant-virus-vector-symbiont interactions will increase our insight into this field. Key Words Toya propinqua , Symbionts, Paenibacillus , Acinetobacter , Wolbachia , Cardinium , Rickettsia , Spiroplasma , YLS, CCSV, Transmission Efficiency
برهمکنش های بین میزبان و میکروارگانیسم های همراه می تواند بر روی میزبان تأثیر داشته باشد. یکی از تحقیقات نوظهور در این مورد، بررسی تأثیر باکتری های همزیست در ناقلین حشره ای و انتقال ویروس های گیاهی توسط آن هاست. به این منظور زنجرک Toya propinqua از علف های هرز گرامینه اطراف مزارع بویژه گیاه مرغ در مناطق اصفهان، مبارکه، زرین شهر و گلپایگان جمع آوری شد. پس از بررسی مقدماتی خصوصیات مورفولوژیکی، زنجرک های جمع آوری شده جهت تکثیر بر روی گیاه مرغ در داخل قفسه های آلومینیومی رها سازی شدند. براساس خصوصیات مورفولوژیک بدن، جنیتالیای حشره نر و توالی یابی ژن سیتوکروم اکسیداز، زنجرک های جمع آوری شده Toya propinqua تشخیص داده شدند. به منظور شناسایی همزیست های باکتریایی قابل کشت زنجرک Toya propinqua ، سوسپانسیون بدن آن ها بر روی محیط NA کشت داده شد. پس از خالص سازی کلنی های رشدکرده، استخراج DNA از آن ها انجام شد و PCR با استفاده از آغازگرهای 27F/1492R صورت گرفت. توالی یابی باندهای تکثیرشده و جستجوی بلاست منتج به شناسایی دو باکتریsp. Paenibacillus و Acinetobacter sp. شد. جهت شناسایی پروکاریوت های همزیست غیرقابل کشت، پس از استخراج DNA، PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی Wolbachia sp. (81F/691R)، Cardinium sp . (CLOF/CLOR1)، Rickettsia sp . (RBF/RBR) و Spiroplasma sp . (Spi-f1/Spi-r3) انجام شد. با توالی یابی باند های تکثیر شده و جستجوی بلاست پروکاریوت های Wolbachia sp. ، Cardinium sp . ، Rickettsia sp . و Spiroplasma sp . شناسایی شدند. بر اساس اطلاعات ما به جزsp. Wolbachia ، سایر همزیست ها برای اولین بار از T. propinqua گزارش می شوند. توالی یابی باند تکثیر شده و جستجوی بلاست نشان دهنده ی وجود این نوع از همزیست ها در T. propinqua بود. به منظور تعیین فراوانی همزیست های Wolbachia sp. ،sp. Cardinium و Rickettsia sp . در جمعیت های T. propinqua ، از شهر های اصفهان، گلپایگان، زرین شهر و مبارکه اقدام به جمع آوری زنجرک گردید و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ردیابی همزیست ها انجام شد. در کل، Wolbachia sp . ، Cardinium sp . وsp. Rickettsia در 75% از زنجرک های مورد مطالعه یافت شدند. حدود 4/94% از نرها و 1/59% از ماده ها دارای همزیست بودند. فراوانیsp. Wolbachia 5/72 %،sp. Cardinium 45% و Rickettsia sp. 5/%42 برآورد شد. آلودگی منفردsp. Wolbachia در 15% ،sp. Wolbachia sp. + Cardinium در 17% وsp. Wolbachia sp. + Rickettsia در 15% و هر سه همزیست در 25% از زنجرک ها محاسبه شد. درمجموع، حضور sp. Wolbachia در کلنی های آزمایشگاهی حدود 3/82% و sp. Rickettsia حدود 4/ 73% برآورد گردید. آلودگی همزمان این دو همزیست 70% محاسبه شد و 9/8% از زنجرک ها فاقد این دو همزیست بودند. انتقال ویروس رگه سبزرد مرغ(CCSV) cynodon chlorotic streak virus در شرایط آزمایشگاهی توسط T. propinqua انجام و راندمان آن بررسی شد. نتایج نشان داد 21/54 درصد از پوره ها و بالغین قادر به انتقال ویروس از مرغ آلوده به یولاف بودند. به منظور تعیین تأثیر درون همزیست هایsp. Wolbachia وsp. Rickettsia بر انتقال ویروس رگه سبزرد مرغ توسط T. propinqua ، زنجرک ها در آزمون انتقال بررسی شدند. ابتدا زنجرک ها به مدت سه روز بر روی مرغ آلوده قرار گرفتند و سپس بر روی مرغ سالم به مدت یک ماه نگهداری شدند. پس از طی دوره کمون زنجرک ها به صورت تکی بر روی گیاه یولاف در مرحله کلئوپتیل قرار داده شدند. زنجرک ها پس از سه روز به فریزر C° 80- منتقل شدند. از برگ گیاهان یک ماه پس از انتقال، RNA کل استخراج و در RT-PCR با آغازگر های اختصاصیCCSVIrF/CCSVIrR بررسی شدند. از زنجرک ها نیز DNA استخراج و همزیست های . Wolbachia وsp. Rickettsia در آن ها توسط PCR با آغازگر های اختصاصی ردیابی شدند. تجزیه و تحلیل داده های حاصل با استفاده از آزمون tنشان دهنده تأثیرsp. Wolbachia و sp. Rickettsia به ترتیب در کاهش وافزایش راندمان انتقال CCSV در جمعیت مورد بررسی از T. propinqua بود. تمرکز پژوهش های آینده بر روی برهمکنش های چهار گانه گیاه- ویروس-ناقل-همزیست باعث افزایش بینش ما در این زمینه می گردد. کلمات کلیدی : Toya propinqua ، همزیست، Paenibacillus ، Acinetobacter ، Wolbachia ، Cardinium ، Rickettsia ، Spiroplasma ، YLS، ویروس رگه سبزرد مرغ، راندمان انتقال

ارتقاء امنیت وب با وف بومی