SUPERVISOR
Amir Massah,Nematola Etemadi shalamzari
امیر مساح (استاد راهنما) نعمت اله اعتمادی شلمزاری (استاد مشاور)
STUDENT
Reza Tahvildari
رضا تحویلداری
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1392
TITLE
Detection and Molecular Identification of Important Viruses Infecting Alstroemeria with Mosaic Symptoms in Isfahan Province
Alstroemeria is a monocot plant belonging to the order Liliales and family Alstromeriace. Alstroemeria is known as one of the most important cut flowers in Iran and all over the world. Since alstroemeria is typically propagated by dividing rhizome, viruses cause severe losses to alstroemeria. Mosaic is one of the most common symptoms in alstroemeria. So far, more than ten viruses have been reported on alstroemeria. Since lack of information on viruses infecting alstroemeria with mosaic symptoms in Iran, during 1393-1394 samples showing mosaic symptoms were collected from alstroemeria greenhouses and flower shops in Isfahan and Chaharmahal va Bakhtiari provinces. The collected samples were grouped based on symptom type including chlorotic stripes, common mosaic and interveinal chlorosis. Total RNA and DNA were extracted with Lithium Chloride and Murray Thompson methods, respectively. Total RNA was subjected to RT-PCR for detecting Alstroemeria mosaic virus (AlsMV), Alstroemeria virus X (AlsVX), Youcai mosaic virus (YoMV), Broad bean wilt virus-2 (BBWV2), Cucumber mosaic virus (CMV), Freesia mosaic virus (FreMV). The extracted total DNA was used for detecting Pepper huasteco yellow vein virus (PHYVV) in PCR. The results showed that only the expected bands of AlsMV were amplified using MJ1/MJ2 (300 bp) and MJ1/AnchoroligodT (900 bp) primer pairs. The replicons were cloned and sequenced. The BLAST search revealed high homology of sequenced fragments with AlsMV sequences available at GenBank. The specific primer pair AlsMf1/AlsMr2 was designed for amplifying NIb, coat protein and 3' UTR regions of AlsMV isolates. For comparison of NIb, coat protein and 3' UTR regions, total RNA of five isolates representing different symptoms and locations including AS1 and AS2 (with chlorotic stripes symptom from Chaharmahal va Bakhtiari), AS4 (with common mosaic symptom from Chaharmahal va Bakhtiari), AI2 (with common mosaic symptom from Isfahan) and AD5 (with interveinal chlorosis from Isfahan) were subjected to RT-PCR using AlsMf1/AlsMr2 primer pair. The expected band of 1800 bp was amplified in all samples. The replicons were cloned and sequenced. The sequencing results showed the amplified fragments had two different sizes (1785bp and 1738bp) corresponding to NIb, CP and 3' UTR regions of AlsMV. Multiple alignment of nucleotide sequence of NIb, CP and 3' UTR regions of AlsMV Iranian isolates and those of other isolates available at GenBank was done using CLC Sequence Viewer 7.5 software. The results showed the shorter fragments (1738bp) have shorter 3' UTR comparing to the larger fragments due to deletion of 47 nucleotides in this region. The average homology (98.7%) was found among different Iranian isolates. The highest homology (99.5%) was seen between an isolate from Japan with accession number (AB158522) and AD5 and AI2 Iranian isolates. The lowest homology (95.8%) was found between an isolate from Taiwan with accession number (DQ295032) and AS1 and AS2 Iranian isolates. Phylogenetic tree was drawn based on nucleotide sequence of NIb, CP and 3' UTR regions of AlsMV Iranian isolates and those of other isolates available at GenBank using Neighbor joining method with DNAMAN 4.0 software. In phylogenetic analyses the isolates with chlorotic stripes symptom and shorter 3' UTR (AS1 and AS2 isolates) clustered in a distinct clade and were separated from other isolates. There was no correlation between clustering and geographical locations. To the best of our knowledge this is the first report of AlsMV in Iran. Keywords: Alstroemeria mosaic virus , Symptom type, Coat protein, NIb and 3' UTR
آلسترومریا ( Alstroemeria .) گیاهی تک لپه ای متعلق به راسته ی سوسن ها (Liliales) و خانواده ی آلسترومریاسه ( Alstroemeriace ) می باشد. آلسترومریا بومی امریکای جنوبی است و به عنوان یکی از مهمترین گیاهان زینتی شاخه بریده در ایران و جهان محسوب میشود. با توجه به این که آلسترومریا از طریق ریزوم تکثیر می یابد، بیماری های ویروسی خسارت زیادی را به این گیاه وارد می آورند و تشخیص و کنترل عوامل بیماریزای ویروسی در آن از اهمیت زیادی برخوردار است. علایم موزاییکی از جمله علایم شایع در مراکز تولید این گیاه میباشد. تاکنون برروی جنس آلسترومریا بیش از 10 گونه ویروسی گزارش شده است. مهمترین ویروس آلوده کننده آلسترومریا، ویروس موزاییک آلسترومریا Alstroemeria mosaic virus (AlsMV)، می باشد. علی رغم شیوع علایم موزاییکی برروی آلسترومریا در بسیاری از گلخانههای پرورش دهندهی این گیاه در ایران، کار تحقیقی جامعی برروی عوامل ایجاد کننده آن صورت نگرفته است. از این رو طی سالهای 1393-1394 از مراکز تولید و فروش گیاه آلسترومریا در استانهای اصفهان و چهارمحال و بختیاری نمونههای دارای علایم موزاییک روی برگ در سه تیپ، شامل زردی بین رگبرگها، موزاییک معمولی و خطوط کلروتیک، جمعآوری و RNA کل به روش لیتیوم کلراید و DNA کل به روش موری و تامسون از آنها استخراج گردید. محصول استخراج RNA جهت ردیابی ویروس موزاییک آلسترومریا Alstroemeria mosaic virus (AlsMV)، ویروس ایکس آلسترومریا Alstroemeria virus X (AlsVX)، Youcai mosaic virus (YoMV)، ویروس پژمردگی باقلا-2 Broad bean wilt virus-2 (BBWV2)، ویروس موزاییک خیار Cucumber mosaic virus (CMV) و ویروس موزاییک فریزیا Freesia mosaic virus (FreMV) و نیز محصول استخراج DNA جهت ردیابی Pepper huasteco yellow vein virus (PHYVV) مورد استفاده قرار گرفت. محصول استخراج RNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی گونه و یا جنس ویروسی تحت واکنش RT –PCR قرار گرفت. همچنین محصول استخراج DNA به طور مستقیم به همراه آغازگرهای اختصاصی جنس بگوموویروس که Pepper huasteco yellow vein virus متعلق به آن جنس است؛ در PCR مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل از PCR نشان داد که تنها باندهای مورد انتظار bp300 و bp900 مربوط به ویروس موزاییک آلسترومریا به ترتیب با استفاده از جفت آغازگرهای MJ1/MJ2 و MJ1/AnchoroligodT، در تعدادی از نمونه ها تکثیر شدند. قطعات تکثیر شده همسانه سازی و جهت توالی یابی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال گردیدند. بررسی توالی ها با استفاده از نرم افزار بلاست نشان دهنده شباهت بالای آن ها با توالی های AlsMV موجود در بانک ژن بود. پس از تایید نتایج توالی یابی با استفاده از نرمافزار بلاست، توالیهای بهدست آمده به همراه توالیهای ثبت شده در بانک ژن که شامل دو توالی با طول تقریبی bp1800 و یک توالی با طول bp255 بود؛ جهت طراحی آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده قرار گرفتند. از آغازگرهای طراحی شده، جفت آغازگر AlsMf1/AlsMr2 به عنوان آغازگر مناسب جهت تکثیر نواحی پروتیین پوششی، NIb و ناحیه غیر کدشوندهی انتهای '3 ژنوم (3'-UTR) تشخیص داده شد. به منظور مقایسه مولکولی جدایههای ویروس موزاییک آلسترومریا، تعداد پنج جدایه بر اساس تیپ علایم و منطقه به نام های AD5، AI2، AS1، AS2 و AS4 انتخاب شدند. cDNA جدایههای جمعآوری شده با استفاده از آغازگر AnchoroligodT در واکنش RT ساخته شد و PCR با جفت آغازگر AlsMf1/AlsMr2، انجام شد. طی واکنش RT-PCR قطعات مورد انتظار با طول تقریبی bp1800 تکثیر گردیدند. قطعات تکثیر شده همسانهسازی و توالی یابی شدند. نتایج حاصل از توالی یابی وجود دو قطعه به طول های bp1785 و bp1738را نشان داد. همردیف سازی چندتایی توالی نوکلئوتیدی ژن پروتیین پوششی، NIb و ناحیه غیر کدشوندهی انتهای '3 ژنوم جدایههای این تحقیق با جدایههای موجود در بانک ژن به کمک نرمافزار CLC Sequence Viewer 7.5 انجام شد. نتایج همردیف سازی نشان داد که قطعات تکثیری با اندازهی bp1738 نسبت به قطعات تکثیری با اندازهی bp1785 به اندازه47 نوکلئوتید دارای حذف در ناحیهی 3'-UTR میباشند. میزان متوسط تشابه توالی نوکلئوتیدی ژن پروتیین پوششی، NIb و ناحیه غیر کدشوندهی انتهای '3 ژنوم در بین جدایههای این تحقیق 7/98 درصد محاسبه گردید. بیشترین و کمترین میزان تشابه به ترتیب بین جدایههای AD5 و AI2 و جدایه ژاپن (5/99 درصد) با شماره دسترسی (AB158522) و جدایههای AS1 و AS2 و جدایه تایوان (8/95 درصد) با شماره دسترسی (DQ295032) مشاهده شد. درخت تبارزایی با استفاده از روش Neighbor joining بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن پروتیین پوششی، NIb و ناحیه غیر کدشوندهی انتهای '3 ژنوم با استفاده از نرمافزار DNAMAN 4.0 رسم گردید. نتایج حاصل نشان داد که جدایههای دارای علایم خطوط کلروتیک و دارای ناحیه 3'-UTR کوتاه تر (جدایههای AS1 و AS2) در یک گروه جداگانه قرار می گیرند و از بقیه جدایه ها تفکیک شدند. هیچ گونه ارتباطی بین گروهبندی و منطقه جغرافیایی مشاهده نشد. با توجه به اطلاعات موجود، این اولین گزارش از وجود ویروس موزاییک آلسترومریا در ایران می باشد. کلمات کلیدی: ویروس موزاییک آلسترومریا، تیپ علایم، پروتیین پوششی، NIb و ناحیهی غیر کدشوندهی انتهای'3