Skip to main content
SUPERVISOR
Jahangir Khajehali,Masoud Bahar
جهانگیر خواجه علی (استاد مشاور) مسعود بهار (استاد راهنما)
 
STUDENT
Alireza Salimi Darani
علیرضا سلیمی دارانی

FACULTY - DEPARTMENT

دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1396

TITLE

Detection and physiological characterization of isolates of Dickeya solani and Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense in potato fields of Isfahan province
Potato blackleg and soft rot diseases caused by Pectobacterium and Dickeya species and suecies are considered to be the most destructive bacterial diseases of potato worldwide. For a long time, Pectobacterium caratovorujm su. carotovorum and P . atrosepticum were known as the main agents of potato soft rot and blackleg diseases. In recent years, however; the significant prevalence of D. solani and P. carotovorum su. brasiliense (Pcb) in soft rotted potato samples implied the important role of these bacteria to cause potato blackleg and soft rot diseases, probably due to global warming. Despite the widespread presence of various species of Pectobacterium . and Dickeya . in potato farms of Iran, there was no evidence for spread of D. solani and P. carotovorum su. brasiliense in field potatoes of Isfahan province. To determine the regional incidence of D. solani and P. carotovorum su. brasiliense , surveys conducted in potato grown area of Isfahan province during June - October, 2019 and stem, root and tuber samples with symptoms of blackleg and soft rot were collected from the visited farms. After isolating bacteria from symptomatic potato organs, the isolates were characterized by pectolytic, biochemical and molecular tests to differentiate the strains belonged to Pectobacteria. The rep-PCR fingerprinting with BOX IR and ERIC2F/ERIC1R primer sets was used for genotypic characterization of the Pectobacteria isolates collected in this study in comparison with reference strains of Pectobacterium . and Dickeya . Combined fingerprinting analysis classified the isolates into eight groups. Further characterization of the isolates in each group, using PCR assays with specific primer pairs including Y1/Y2, ADE1/ADE2, ECA1f/ECA2R, BR1f/L1R, PwaF/PwaR, for Pectobacterium and Dickeya species and suecies in combination of biochemical tests, revealed that out of 84 bacterial strains isolated from symptomatic potato plants in this study, 13 strains were identified as P. carotovorum su. brasiliense , 3 strains D. solani , 42 strains P. carotovorum su. carotovorum, 17 strains P. wasabie and 6 strains Dickeya . The remaining three isolates yet to be identified as their characteristics did not match with any described species of genera Pectobacterium or Dickeya . In order to determine the differences in pectolytic activity of the species identified in this study, in vitro potato slice rot tests of the representative strains of species were conducted at different incubation temperatures: 5?, 15?, 28?, 37? and 39?. All examined species and suecies exhibited pectolytic activities at various temperatures, although there were certain variation between the species and also among the isolates of each species. Due to lack of species–specific primer pair for the distinctive identification of D. Solani , based on a sequence of a unique 950 bp fragment amplified in D. solani in ERIC2F/ERIC1R fingerprinting, a specific primer pair were designed to amplify a single and reproducible 895 bp band in D. solani strains. The application of a series of PCR tests confirmed the specificity and sensitivity of the primer pair for exclusive diagnosis of D. solani strains. Apparently, the proposed PCR assay demonstrated to be a quick and reliable method for detection and distinguishing D. solani from other Pectobacteria. Keywords : soft rot, blackleg, D. solani , P. carotovorum su. brasiliense, primer design, specific primer pair, pectolytic activity
بیماری های ساق سیاه و پوسیدگی نرم سیب زمینی از بیماری های باکتریایی خسارت زای سیب زمینی در دنیا می باشند که توسط گونه ها و زیرگونه های مختلفی از Pectobacterium . و Dickeya . ایجاد می شوند. طی مدتی طولانی، دو باکتری Pectobacterium carotovorum su. carotovorum و P. atrosepticum به عنوان شایع ترین عوامل بروز ساق سیاه و پوسیدگی نرم سیب زمینی شناخته می شدند، ولی در سال های اخیر حضور D . solani و P . carotovorum su. brasiliense در نمونه های ساق سیاه و پوسیدگی نرم مزارع سیب زمینی دنیا اهمیت بیشتری یافته است، که احتمالاً به دلیل گرمایش جهانی، این دو باکتری نقش مهم تری در بروز این بیماری ها پیدا کرده اند. با وجود گزارش گونه های مختلفی از Pectobacterium . و Dickeya . از مزارع سیب زمینی ایران، اطلاعات مشخصی از شیوع D . solani و P . carotovorum su. brasiliense در مزارع اصفهان وجود نداشت. برای تعیین وضعیت انتشار این دو باکتری در منطقه، طی ماه های تیر تا مهر ماه سال 1398 از نواحی سیب زمینی کاری استان اصفهان بازدید هایی به عمل آمد و از ساقه، ریشه و غده های دارای علایم ساق سیاه و پوسیدگی نرم غده نمونه برداری شد. پس از جداسازی باکتری از بافت های گیاهی آلوده، با استفاده از آزمون های پکتولیتیکی، بیوشیمیایی و مولکولی، جدایه های متعلق به گروه های پکتوباتریومی مشخص شدند. در انگشت نگاری ژنتیکی با استفاده از جفت آغازگرهای BOXA1R و ERIC2F/ERIC1R، مشخصات ژنوتیپی جدایه های بدست آمده در این تحقیق در مقایسه با جدایه های رفرانس Pectobacterium . و Dickeya . تعیین گردید. بر اساس نتایج تجمیعی انگشت نگاری ژنتیکی، جدایه ها در هشت گروه طبقه بندی شدند. در بررسی های بعدی، طی آزمایشات PCR با جفت آغازگرهای اختصاصی شامل Y1/Y2، ADE1/ADE2، ECA1f/ECA2R، BR1F/L1R، PwaF/PwaR و همچنین آزمون های بیوشیمیایی، گونه ها و زیرگونه های ectobacterium . و Dickeya . مشخص شدند که از 84 نمونه ی باکتریایی به دست آمده از سیب زمینی های آلوده به ساق سیاه و پوسیدگی نرم مورد بررسی در این پژوهش، 13 جدایه P. caratovourum su. brasiliense ، سه جدایه D. solani ، 42 جدایه P. caratovourum su. caratovourum ، 17 جدایه P. wasabiae و شش جدایه متعلق به جنس Dickeya . هستند و سه جدایه دیگر، بدلیل عدم تطبیق مشخصات مولکولی و بیوشیمیایی با گونه های مربوط به جنس های Pectobacterium یا Dickeya نامشخص باقی ماندند. به منظور تعیین تفاوت فعالیت پکتولیتیکی گونه های شناسایی شده طی این پژوهش، آزمون لهیدگی برش های غده ی سیب زمینی برای آن ها تحت دماهای نگهداری مختلف ?5، ?15 ، ?28 ، ?37 و ?39 انجام گرفت. همه گونه ها و زیر گونه های مورد آزمایش در دماهای مختلف، فعالیت پکتولیتیکی نشان دادند، هرچند که بین فعالیت جدایه های گونه های مختلف و نیز جدایه های درون هرگونه تفاوت هایی وجود داشت. به دلیل عدم وجود یک جفت آغازگر اختصاصی برای شناسایی D . solani ، بر اساس توالی نوکلئوتیدی یک باند انحصاری 950 نوکلئوتیدی تکثیر شده از D. solani در انگشت نگاری ژنتیکی با ERIC2F/ERIC1R، یک جفت آغازگر اختصاصی برای تکثیر باندی منفرد و تکرار شونده از ژنوم D.solani طراحی شد. با بکارگیری یک سری از آزمون های PCR، اختصاصیت و حساسیت این جفت آغازگر برای تشخیص انتخابی جدایه های D. solani تایید گردید. بنظر می رسد که آزمون PCR پیشنهاد شده در این تحقیق با استفاده از جفت آغازگر طراحی شده DSF1/DSR2 می تواند یک روش سریع و قابل اعتماد برای ردیابی و تشخیص D. solani از سایر باکتری های پکتوباکتریومی باشد. کلمات کلیدی: پوسیدگی نرم، ساق سیاه، Dickeya solani ، Pectobacterium carotovorum su . brasiliense ، طراحی آغازگر، آغازگر اختصاصی، فعالیت پکتولیتیکی

ارتقاء امنیت وب با وف بومی