تاثیر بیان دگر ساخت ایزوفرم های کلاس I و II متالوتیونین برنج (Oryza sativa) بر روی تحمل باکتری Esherichia coli به فلزات سنگین

STUDENT

DEGREE

YEAR

The contamination of heavy metals either by natural sources or industrial activities has brought significant deleterious consequences to the environment and organisms’ health. To balance the concentration of toxic metals in the cells, all organisms possess different potential cellular mechanisms such as synthesis of metal binding peptides and proteins. Metallothioneins (MTs), are a superfamily of small (molecular weight 10 KDa) and Cys-rich proteins that can bind heavy metals via the thiol groups of their Cys residues. A total of 13 genes encoding putative MT proteins have been identified in rice ( Oryza sativa ) which are justify; LINE-HEIGHT: 115%; MARGIN: 0in -11.35pt 0pt; unicode-bidi: embed; DIRECTION: ltr" Keyword : Rice, Metallothionein, Heavy Metals, Protein Expression, Cloning, Oxidative Stress

آلودگی فلزات سنگین در اثر عوامل طبیعی یا فعالیت های صنعتی، پیامدهای مخرب چشمگیری را بر محیط زیست و سلامت موجودات زنده به همراه دارد. به همین دلیل، در سلول های موجودات زنده مکانیسم های مختلفی به منظور تعدیل غلظت فلزات وجود دارد. از جمله این مکانیسم ها می توان به کلاته شدن فلزات توسط پروتئین هایی با قابلیت بالا در اتصال به فلزات اشاره کرد. متالوتیونین ها (MT) خانواده ای از پروتئین های کوچک با وزن مولکولی کمتر از 10 کیلودالتون و غنی از آمینواسیدهای سیستئین هستند که ظرفیت بالایی برای اتصال به فلزات سنگین از طریق گروه های تیول سیستئین های خود دارند. در ژنوم گیاه برنج، 13 جایگاه ژنی کدکننده ی پروتیئن های MT شناسایی شده است که براساس الگوی توزیع سیستئین ها درتوالی آمینواسیدی، در دو کلاس I و II طبقه بندی می شوند. بیشتر مطالعات بر روی MT ها در گیاهان به بررسی بیان این ژن ها در بافت های مختلف محدود شده است و تحقیقات اندکی تاکنون بر روی نقش هر ایزوفرم MT در سطح پروتئین صورت گرفته است. تحقیق حاضر با هدف مقایسه نقش دو ایزوفرم OsMTI - 1b و OsMTII - 1a به ترتیب متعلق به کلاس I و II ژن های MT برنج، در ایجاد تحمل به تنش فلزات سنگین و هم چنین تنش های اکسیداتیو انجام شد. توالی کد کننده ی این ایزوفرم ها سنتز و در ناقل بیانی pET41a همسانه سازی شد. پس از تائید صحت همسانه سازی با استفاده از توالی یابی، دستواره های تولید شده به میزبان بیانی E. coli سویه ی Rosetta(DE3) منتقل شدند. با القاء بیان پروتئین توسط IPTG، میزان قابل توجهی از پروتئین های GST (نمونه ی شاهد)، GST-OsMTI-1b و GST-OsMTII-1a تولید شد. تحمل سویه های بیان کننده ی پروتئین های نوترکیب به فلزات سنگین از طریق ترسیم منحنی رشد باکتری ها در حضور نمک های CuSO 4 ، ZnSO 4 ، CdCl 2 و NiCl 2 و هم چنین اندازه گیری میزان تجمع فلز در داخل سلول های باکتری و کاهش آن از محیط کشت با استفاده از دستگاه طیف سنجی نشر اتمی پلاسمای جفت شده القائی (ICP-AES) بررسی شد. با خالص سازی پروتئین های نوترکیب، امکان بررسی تمایل و ظرفیت اتصال آن ها به فلزات مختلف در مقایسه با نمونه ی شاهد فراهم گردید. به این منظور از روش های مختلف شامل بررسی تغییر در الگوی جذب نور، تعیین محتوای یون های فلزی توسط دستگاه ICP و همچنین واکنش با معرف اِلمن استفاده گردید. نتایج حاصل از بررسی تحمل سویه های نوترکیب به فلزات نشان داد بیان پروتئین GST-OsMTI-1b موجب افزایش تحمل سلول های باکتری به فلزات کادمیوم، نیکل و روی می شود، در حالی که در سلول های بیان کننده ی پروتئین GST-OsMTII-1a تنها افزایش تحمل اندکی در برابر فلزات نیکل و روی مشاهده گردید. هیچ کدام از دو ایزوفرم OsMT موجب افزایش تحمل سلول های باکتری به فلز مس نشد. از واکنش معرف المن با پروتئین های نوترکیبی که چه در محیط داخل سلول های باکتری و چه پس از خالص سازی در معرض فلزات قرار گرفته بودند، مشخص گردید تمایل پروتئین GST-OsMTI-1b برای فلزات بررسی شده به ترتیب Cd/Ni Z Cu می باشد. همچنین با اندازه گیری میزان فلزات اتصال یافته به پروتئین های نوترکیب مشخص شد هر مول از پروتئین GST-OsMTI-1b، ظرفیت اتصال به 25/6، 86/4 و 9/4 مول از فلزات نیکل، کادمیوم و روی را دارد. در مقایسه با GST-OsMTI-1b، فلزات اتصال یافته به پروتئین GST-OsMTII-1a قابل چشم پوشی بود که حاکی از عدم تمایل این پروتئین در اتصال به فلزات بررسی شده می باشد. به منظور بررسی نقش دو ایزوفرم OsMTI - 1b و OsMTII - 1a در پاکسازی گونه های فعال اکسیژنی (ROS)، نحوه ی رشد باکتری های بیان کننده ی پروتئین های نوترکیب در مقایسه با شاهد در محیط های کشت حاوی هیدروژن پراکسید (H 2 O 2 ) واتانول بررسی شد. بیان هر دو پروتئین نوترکیب، به مقدار قابل توجهی رشد سلول های باکتری را در حضور H 2 O 2 افزایش داد، در حالی که در ببرابر تنش اتانول تأثیر مشخصی نداشت. نتایج این تحقیق به خوبی تفاوت نقش دو ایزوفرم OsMTI-1b و OsMTII-1a ، متعلق به کلاس I و II برنج، را نشان داد که می تواند بیانگر نقش اختصاصی آن ها در گیاه برنج نیز باشد. واژگان کلیدی : برنج، متالوتیونین، فلزات سنگین، همسانه سازی، بیان پروتئین، تنش اکسیداتیو