اثر انجماد شیشه‌ای رویان موش بر تغییرات هیستونی و بیان ژن آنزیمهای تغییر دهندهی هیستونی

STUDENT

DEGREE

YEAR

Epigenetic biomarkers in preimplantation embryos are critical for appropriate embryonic development. While ARTs are considered to be safe, some studies suggest that ARTs manipulations may perturb the epigenetic information and subsequently the health of the offspring. The aim of this study was to evaluate the effects of superovulation, vitrification, in vitro culture and embryo transfer on a panel of epigenetic biomarkers in blastocysts and expression of enzymes involved in histone modifications and pluripotency markers genes in blastocysts and E9.5. Results showed that vitrification decreased the developmental competence of embryos cultured in vitro ( P 0.05). Semi-quantitative analysis revealed that vitrification significantly affects the fluorescence intensity of H4K12 acetylation in trophectoderm (TE) in comparison to C group P 0.05). Superovulation, in S group, significantly elevated the level of H3K9 acetylation and H3K4 tri-methylation in ICM ( P 0.05). ART manipulations influence the H3K9 acetylation ( P 0.05) but not H3K4 tri-methylation in TE ( P 0.05). Assisted reproductive techniques influenced most genes expression (5 of 7 genes) in the blastocysts ( P 0.05). In next step, this perturbed mRNA expression restrict to E9.5 superovulated fetuses and placentae. It is likely that hormonal stimulation in the superovulated mice alters the environment of the uterus, which adversely affects the normal epigenetic patterns of the resultant Key Words histone epigenetic modifications, superovulation, vitrification, gene expression, blastocyst, E9.5 concepti

در عالم طبیعت هنگامی که لقاح صورت می گیرد،گامت نر و گامت ماده، طی دو فرآیند شکل گیری مجدد هسته ای و برنامه ریزی مجدد هسته ای به وضعیت کاملاً تمایز نیافته و همه توان بر می گردند. طی فرآیند برنامه ریزی مجدد هسته ای، تغییرات پیچیده اپی ژنتیکی در ژنوم رویان، چه در سطح DNA و چه در سطح هیستون ها رخ می دهد که اثر بسیار مهمی بر روی تکوین یک موجود دارد. از آن جایی که در پستانداران عوامل محیطی طی اوایل تکوین نقش تعیین کننده ای را در تنظیم اپی ژنتیکی بر عهده دارند، از این رو در این رساله به بررسی اثر روش های کمک تولید مثلی بر میزان زنده مانی و توانایی نمو و هم چنین ارزیابی چند نشانگر اپی ژنتیکی هیستونی در مرحله ی پیش از لانه گزینی و بیان ژن آنزیم های درگیر در این تغییرات و نیز بیان ژن نشانگرهای پرتوان Sox2 ، Pou5f1 و Nanog در دو مرحله ی‌ پیش از لانه‌گزینی و پس از آن پرداخته شد. هم چنین به منظور بررسی اثر روش های کمک تولیدمثلی بر روی میزان توانایی نمو جنین، میزان جایگاه جذب و جایگاه لانه گزینی و هم چنین وزن جفت و جنین در روز 5/9 جنینی مورد بررسی قرار گرفت. در مرحله ی پیش از لانه گزینی چهار گروه تیماری شامل گروه هایC (کنترل)، S (تحریک تخمک ریزی)، SI (تحریک تخمک ریزی + کشت در شرایط برون تنی) و SVI (تحریک تخمک ریزی + انجماد شیشه ای + کشت در شرایط برون تنی) مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان داد که میزان تشکیل بلاستوسیست و شکوفایی بلاستوسیست در گروه SVI به میزان معنی داری پائین تر از گروه SI می باشد (05/0 P ). آنالیز نیمه کمی نشانگرهای اپی ژنتیکی در تروفکتودرم نشان داد که گروه C پائین ترین شدت نور فلورسنت هسته ای را برای این سه نشانگر دارا می باشد و این تفاوت تنها برای استیله شدن 9K3H معنی دار بود (05/0 P ). برای استیله شدن 12K4H میزان شدت نور فلورسنت در گروه SVI به میزان معنی داری بالاتر از گروه های وC بود که این تفاوت را می توان به تنش حاصل شده از مواد محافظ انجمادی و سرمای وارد شده به این سلول ها نسبت داد. بررسی این نشانگرها در توده ی درونی سلولی نشان داد که گروه برای استیله شدن 9K3H نسبت به گروه های C و SI و برای تری متیله شدن 4K3H نسبت به گروه SI وSVI به میزان معنی داری بالاتر بود (05/0 P ). این نتیجه را می توان این گونه توضیح داد که تخمک های به دست آمده از موش های تحریک تخمک ریزی شده ممکن است به اندازه تخمک های حاصله از موش هایی که سیکل طبیعی داشتند، توانا نباشند. برپایه این فرض انتظار می رود که بلاستوسیست های به دست آمده از گروه های SI و SVI میزان بالایی از استیله شدن 9K3H و تری متیله شدن 4K3H را داشته باشند اما در عمل چنین نبود. این تفاوت ها می تواند به این دلیل باشد که تخمک های نامناسب به دست آمده از تحریک تخمک ریزی ممکن است در گروه های SI و SVI تحت کشت در شرایط برون تنی و انجماد شیشه ای به مرحله بلاستوسیست نرسیده باشند و در نتیجه بلاستوسیست هایی که از تخمک های با شایستگی بالا حاصل شده اند در این گروه ها مورد ارزیابی قرار گرفته اند. بنابراین میزان این تغییرات اپی ژنتیکی در دو گروه SI و SVI شبیه به گروه C است. بررسی نتایج حاصل از بیان ژن ها در این مطالعه نشان داد که دستکاری های موجود در روش های کمک تولید مثلی القاء کننده ی الگوی بیانی غیر طبیعی ژن ها در این مرحله می باشند. از آن جایی که در تمام ژن های بررسی شده در رویان در مرحله ی بلاستوسیست تفاوت معنی داری در میزان بیان ژن بین گروه های تیماری SI و SVI دیده نشد، می توان گفت که انجماد شیشه ای رویان دو سلولی موش اثرخاصی بر میزان بیان ژن آنزیم های درگیر در تغییرات اپی ژنتیکی و هم چنین بیان ژن نشانگرهای پرتوان بررسی شده در مرحله ی پیش از لانه گزینی، در مقایسه با کشت در شرایط برون تنی ندارد. به منظور بررسی های پس از لانه گزینی علاوه بر داشتن دو گروه C و S، گروه های CT، ST، SIT و SVIT هم که در آن ها عمل انتقال رویان علاوه بر دستکاری های دیگر صورت گرفته بود مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج نشان داد که با افزایش دستکاری ها، درصد جایگاه جذب افزایش و وزن جنین کاهش می یابد. کاهش وزن جنین در گروه تیماری S که تنها تیمار تحریک تخمک ریزی بر روی آن ها صورت گرفته بود نسبت به گروه C معنی دار بود (05/0 P ). داده های به دست آمده از بیان ژن ها در جنین 5/9 روزه نشان داد که میزان بیان بیشتر ژن ها در گروه تیماری S، با گروه های دیگر متفاوت است. دلیل این تفاوت را می توان این گونه توضیح داد که تحریک تخمک ریزی باعث آزادسازی تخمک های غیرطبیعی گردد. این اتفاق از طریق وادار کردن تخمک ها برای تکوین خیلی سریع و یا آزاد شدن تخمک هایی که از قبل برای پس روی کردن انتخاب شده‌اند، صورت می‌گیرد. بنابراین نشانگرهای اپی ژنتیکی در این گروه ها دستخوش تغییر شده والگوی بیان ژن ها نیز غیر طبیعی می شود. هم چنین تزریق اگزوژنوسی هورمون‌ها می‌تواند باعث شود که میزان استرادیول سرم خون نسبت به گروه کنترل که چرخه ی تخمک ریزی طبیعی دارد افزایش یافته و شرایط متفاوتی در محیط رحم حاصل شود واثر منفی بر وضعیت بیان ژن ها بگذارد.