ارزیابی انتقال بیماری های فایتوپلاسمایی از طریق غده های بذری سیب زمینی

STUDENT

DEGREE

YEAR

Potato purple top and witches’ broom are two destructive phytoplasmal diseases distributed widely in potato growing areas of the world and Iran. These diseases with symptoms including stunting, flagging, yellowing, purpling, witches’ broom and formation of little leaves and aerial tubers cause considerable losses in potato farming. Although Candidatus Phytoplasma solani, Ca. P. trifolii and Ca. P. asteris are known as causal agents of potato purple top and witches’ broom diseases, the latest surveys have shown that Ca. P. solani and Ca. P. trifolii are more prevalent in potato producing regions of Iran comparing to low incidence of Ca. P. asteris . The Potato phytoplasmas are transmitted by leafhoppers and seed tubers; however, the rate of phytoplasma transmission through potato seed tubers in different generation has remained unclear. In order to investigate transmission process of potato phytoplasmas through seed tubers, symptomatic potato plants with their daughter tubers were collected from potato growing fields of Isfahan(Nazhvan, Damaneh, Fereydounshahr and Chadegan) and Chaharmahal-o-bakhtyari (Faradonbeh and Sefiddasht). DNA extracted from each plant was diluted and subjected to PCR reaction using universal primer pairs P1/P7 or P1A/P7A followed by nested-PCR with primer pairs R16F2n/R16R2. Of the 73 samples tested , a DNA fragment of approximately 1239bp in size was amplified in 47 samples verifying their infection to phytoplasma agents. Concerning to specific identification of phytoplasmas associated with potato, two specific primer pair sets Solani12F/R and Stol12F/R with amplicon fragments of 680bp and 620bp respectively were designed for diagnosis of Ca. P. solani and also TRF6F/R with amplicon fragment of 509bp was worked out based on the 16SrRNA region of Ca. P. trifolii. In PCR reactions with the Solani12F/R and Stol12F/R primer pairs, 35 samples were produced the expected size fragments supporting their identity as Ca. P. solani. Using the TRF6F/R primer pair, three samples produced a 509 band and were thus determined to belong to Ca. P. trifolii. Based on this species specific detection analysis, nine samples were found mixed infected with both phytoplasmas. It also was turned out that none of the samples infected by Ca. P. asteris using specific primer pairs rp(I)F1A/rp(I)R1A, although Ca. P. asteris has been reported as the prevalent potato phytoplasma worldwide. All the results obtained were confirmed by PCR-RFLP and nucleotide sequencing analyses. To determine the transmission rate of the phytoplasmas via potato seeds, all daughter tubers of the 47 infected samples were grown in greenhouse for 12 weeks. During this time, some of the plants showed symptoms such as witches’ broom, dwarfing, little leaf and purpling, although some others were symptomless. After tuber developments, DNA was extracted from the midribs of each of the samples to use in nested-PCR assays for detection of the exact phytoplasmas in the plants, employing universal and specific primer pairs. According to the results, of the 111 plants tested, 25 were found infected by Ca. P. solani, but none of them amplified the expected fragment for Ca. P. trifolii. Based on the results, the rate of phytoplasma transmission through the seeds was estimated about 22% in second generation of potato plants. High presence of Ca. P. solani and the absence of Ca. P. trifolii in second generation plants raise the notion that Ca. P. solani is more transmissible to progenies, probably due to its higher abundance in the field and concentration inside the host. The deficit of phytoplasma in all tubers of an infected plant suggests uneven distribution of phytoplasma in plants. In order to evaluate the rate of potato phytoplasma tuber transmission in third generation, phytoplasma infected tubers of the second generations were planted in greenhouse. The procedure for assessment of disease symptoms and detection of phytoplasma from the plants by nested PCR using universal and ...

بیماری های سرارغوانی و جاروی جادوگر سیب زمینی، بیماری های مخرب فایتوپلاسمایی هستند که در مناطق سیب زمینی کاری ایران و جهان گسترش قابل توجهی دارند. این بیماری ها با علایمی از قبیل جارویی شدن بوته،کوتولگی، برافراشتگی، ریزبرگی، ارغوانی شدن حاشیه برگها و تشکیل غده های هوایی هرساله خسارات فراوانی به تولید سیب زمینی وارد می آورند. اگرچه سه فایتوپلاسمای Candidatus Phytoplasma solani ، Ca . P. trifolii و Ca . P. asteris به عنوان عوامل بیماری های فایتوپلاسمایی سیب زمینی در ایران معرفی شده اند، ولی تحقیقات سال های اخیر نشان داده است که فقط دو فایتوپلاسمای Ca . P. solani و Ca . P. trifolii، اهمیت زیادی در مزارع سیب زمینی ایران دارند. با وجود انتقال بیماری های فایتوپلاسمایی سیب زمینی از طریق زنجرک ها و غده های بذری، نرخ انتقال فایتوپلاسماهای رایج سیب زمینی از طریق غده های بذری در ایران، در نسل های مختلف، مشخص نیست. به منظور بررسی روند انتقال عوامل فایتوپلاسمایی از طریق غده های سیب زمینی، طی بازدیدهایی از مزارع استان اصفهان(ناژوان، دامنه، فریدونشهر و چادگان) و چهارمحال بختیاری(فرادنبه و سفیددشت)، گیاهان واجد علایم بیماری های فایتوپلاسمایی به همراه غده های آنها جمع آوری شدند. استخراج DNA از این گیاهان به عمل آمد و این نمونه ها پس از رقیق سازی ابتدا تحت واکنش PCR با جفت آغازگرهای P1/P7 و یا P1A/P7A قرار گرفتند و به دنبال آن واکنش Nested-PCR با جفت آغازگر عمومی فایتوپلاسما R16F2n/R16R2 انجام شد. در مجموع از 73 نمونه مورد بررسی، در 47 نمونه قطعه bp1239 تکثیر شد که نشان دهنده آلودگی فایتوپلاسمایی در این بوته ها بود. به منظور شناسایی اختصاصی فایتوپلاسماهای سیب زمینی در این تحقیق، جفت آغازگرهای اختصاصی برای دو فایتوپلاسمای Ca . P. solani و Ca . P. trifolii ، برمبنای ناحیه 16SrRNA، طراحی شد که در نتیجه دو جفت آغازگر Solani12F/R و Stol12F/R با قطعات تکثیری bp680 و bp620 برای ردیابی Ca . P. solani و جفت آغازگر TRF6F/R با قطعه تکثیری bp509 برای شناسایی Ca . P. trifolii معرفی گردیدند. در ردیابی عوامل فایتوپلاسمایی با این جفت آغازگرهای اختصاصی، از 47 نمونه سیب زمینی مورد بررسی، 35 نمونه آلوده به Ca . P. solani، سه نمونه آلوده به Ca . P. trifolii و نه نمونه آلوده به مخلوط هر دو فایتوپلاسما تشخیص داده شدند. همچنین، با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی rp(I)F1A/rp(I)R1A معلوم گردید که هیچکدام از نمونه ها آلوده به Ca . P. asteris نیستند که در مزارع سیب زمینی کشورهای دیگر به عنوان عامل اصلی فایتوپلاسمایی رایج است. آزمون PCR-RFLP با استفاده از آنزیم Kpn I و توالی یابی تعدادی از نمونه های منتخب هر گروه نیز صحت نتایج را تأیید کرد. به منظور تعیین میزان انتقال عوامل فایتوپلاسمایی از طریق غده های سیب زمینی، غده های 47 نمونه مبتلا به آلودگی های فایتوپلاسمایی در گلخانه کشت شدند و پس از رشد گیاهان، استخراج DNA و واکنش های Nested-PCR با جفت آغازگرهای عمومی و اختصاصی در آنها صورت گرفت. براساس نتایج بدست آمده، 25 بوته نسل دوم آلوده به فایتوپلاسما بودند که به این ترتیب میزان انتقال عوامل فایتوپلاسمایی به گیاهان نسل دوم 22% ارزیابی شد. تعدادی از این گیاهان نسل دوم علایم بیماری های فایتوپلاسمایی مانند جارویی شدن، کوتولگی، ریزبرگی و ارغوانی شدن جوانه ها و حاشیه برگها را نشان دادند. ردیابی نمونه های آلوده به فایتوپلاسما در نسل دوم با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی آلودگی تمامی نمونه ها به Ca . P. solani و عدم آلودگی به Ca . P. trifolii را نشان داد. با توجه به نتایج بدست آمده، چنین استنباط شد که Ca . P. solani به دلیل فراوانی حضور در مزرعه و غلظت بالاتر در نمونه ها، توانایی بیشتری در انتقال به گیاهان نسل بعدی دارد. همچنین، عدم انتقال فایتوپلاسما به تمامی غده های حاصل از یک گیاه آلوده نشان دهنده پراکندگی غیریکنواخت فایتوپلاسما در میزبان آلوده بود. برای ارزیابی میزان انتقال فایتوپلاسما به گیاهان نسل سوم، مجدداً غده های آلوده در گلخانه کشت شدند و پس از رشد کامل و بررسی علایم، ردیابی فایتوپلاسما در این گیاهان با استفاده از آغازگرهای عمومی و اختصاصی انجام گرفت. براساس نتایج بدست آمده، تنها پنج نمونه از 54 گیاه کشت شده آلوده به فایتوپلاسمای Ca . P. solani بودند و Ca . P. trifolii در این نمونه ها ردیابی نشد. با اطلاعات بدست آمده چنین فرض شد که فراوانی انتقال فایتوپلاسماهای سیب زمینی در نسل های متوالی کاهش می یابد، ولی همین میزان آلودگی نیز می تواند به عنوان منبع آلودگی برای گسترش بیماری های فایتوپلاسمایی توسط زنجرک ها مهم باشد. کلمات کلیدی : بیماری سرارغوانی، جاروی جادوگر سیب زمینی، انتقال بذری، آغازگرهای اختصاصی