بیان هترولوگ یکی از ایزوفرم های تیپ2 متالوتیونین برنج (oryza sativa) در باکتری اشرشیاکلی وتاثیر آن بر تحمل باکتری به فلزات سنگین

STUDENT

DEGREE

YEAR

To balance the toxic effects of metals in the cells, all organisms possess different potential cellular mechanisms such as synthesis of metal binding peptides and proteins. Metallothioneins (MTs), are a superfamily of small (molecular weight 10 KDa) and Cys-rich proteins that can bind heavy metals via the thiol groups of their Cys residues. Multiple MT isoforms have been identified rice ( Oryza sativa ) which are right; LINE-HEIGHT: 90%; MARGIN: auto auto 0pt; unicode-bidi: embed; DIRECTION: rtl; mso-add-space: auto; mso-layout-grid-align: none" dir=rtl Keywords :Rice, Metallothionein, Heavy Metals ,Heterologouexpression, Metal binding ability .

در سلول های موجودات زنده به منظور کاهش اثرات سمیت فلزات، مکانیزم های مختلفی تعبیه شده است که از آن جمله می توان پروتئین هایی با خاصیت کلاته کردن فلز را نام برد. متالوتیونین ها (MTs) گروهی از پروتئین های با وزن مولکولی کم و سرشار از اسید آمینه سیستئین هستند که بواسطه فراوانی گروه تیول، توانایی پیوند با فلزات مختلف را دارند. MT های گیاهی، مطابق طبقه بندی انجام شده براساس الگوی توزیع اسید آمینه سیستئین، در 4 تیپ تقسیم بندی شده اند. بیشتر مطالعات بر روی MT hy;ها در گیاهان، به بررسی بیان این ژن ها در بافت های مختلف محدود شده است و تاکنون تحقیقات اندکی در خصوص نقش هر ایزوفرم MT در سطح پروتئین صورت گرفته است. این تحقیق بمنظور بررسی نقش پروتئین OsMTI-2b که یکی ایزوفرم های تیپ 2 برنج می باشد در ایجاد تحمل به تنش فلزات سنگین و قابلیت اتصال به فلزات سنگین انجام گردید. توالی ژن کد کننده OsMTI -2b در ناقل بیانی pET41a همسانه سازی شد. پس از تائید صحت همسانه سازی با استفاده از توالی یابی، دستواره تولید شده به میزبان بیانی E . coli سویه ی Rosetta (DE3) منتقل شد. با القاء بیان پروتئین توسط IPTG، میزان قابل توجهی از پروتئین های GST (نمونه شاهد) و GST-OsMTI-2b تولید شد. تحمل سویه های بیان کننده پروتئین های نوترکیب به فلزات سنگین از طریق ترسیم منحنی رشد باکتری ها در حضور نمک های فلزات کادمیوم، نیکل، روی، مس و سرب و هم چنین اندازه گیری میزان کاهش فلزات از محیط کشت با استفاده از دستگاه طیف سنجی جذب اتمی (AAS) بررسی شد. با خالص سازی پروتئین های نوترکیب، امکان بررسی تمایل و ظرفیت اتصال آن ها به فلزات مختلف در مقایسه با نمونه ی شاهد فراهم گردید. به این منظور از روش های مختلف شامل واکنش با معرف اِلمن و همچنین بررسی تغییر در الگوی جذب نور استفاده گردید. نتایج حاصل از بررسی تحمل سویه نوترکیب به فلزات، نشان دهنده افزایش تحمل سلول های باکتری Rosetta-pET-41a-OsTI-2b به فلزات سرب، روی، نیکل و کادمیوم بود. در حالیکه سویه مذکور نسبت به مس مقاومت نشان نداد. اندازه گیری و مقایسه میزان فلز در فاز محیط کشت سویه های شاهد و نوترکیب نشان دادکه پروتئین نوترکیب GST-OsMTI-2b موجب کاهش فلزات سرب، کادمیوم، نیکل، مس و روی بترتیب به میزان 85/15، 07/12، 08/12، 51/10 و 47/12 ppm از محیط کشت گردید. برای اندازه گیری قابلیت اتصال پروتئین به فلزات ابتدا این پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی جذبی خالص سازی شد. پروتیئین در معرض فلزات مختلف قرار گرفت. فرایند دیالیز برای حذف فلز های اتصال نیافته انجام شد. از واکنش پروتئین های حاصله با معرف المن مشخص شد که تمایل پروتئینGST-OsMTI-2b به فلزات بررسی شده بترتیب بصورتgt;Zn Cd Ni Cu می باشد. بعلاوه در این تحقیق قابلیت اتصال پروتئین OsMTI-2b به فلز سرب با قابلیت اتصال سه ایزوفرم دیگر MT برنج به نام های GST-OsMTI-1b، GST-OsMTI-3a و GST-OsMTI-2bکه به ترتیب متعلق به تیپ یک، سه و چهار هستند و قبلا به صورت هترولوگ در باکتری E. coli تولید شده بودند مورد مقایسه قرار گرفت. با استفاده از رسم منحنی رشد و اندازه گیری میزان فلز در فاز محیط کشت سویه های نوترکیب و همچنین بررسی قابلیت اتصال پروتئین های خالص در محیط in vitr oبه نظر می رسید GST-OsMTI-2b در مقایسه با دیگر ایزوفرم ها، مقدار بیشتر سرب را جذب می‌کند. این مطالعه به خوبی نشان داد که ایزوفرم های مختلف MT از یک گیاه قابلیت اتصال متفاوتی به فلزات مختلف دارند. واژگان کلیدی : برنج، متالوتیونین، فلزات سنگین، بیان هترولوگ، قابلیت اتصال پروتئن به فلز