شناسایی و تعیین مقاومت به آنتی بیوتیک Erwinia amylovora، عامل بیماری آتشک گلابی درختان میوه دانه دار در استان اصفهان

STUDENT

DEGREE

YEAR

Fire blight, caused by Erwinia amylovora (Burrill) Winslo wet al .1920, is an important disease of pome fruit trees which has been reported from different rosaceous plants. The first symptoms of the disease usually appear in early spring, during warm and humid weather. Infected flowers and leaves exhibit water-soaking, wilting, shriveling with turning brown the fruits. The infected fruits have greasy appearance with often exuding droplets of bacterial ooze. For many years, E. amylovora has been causing outbreaks of fire blight disease in different regions of Iran ; however the incidence of the disease on apple, pear and quince trees in Shahin Shahr, Meimeh and Natanz, revealed that Esfahan province is also under threat of fire blight. In this study, the strains of the pathogen were isolated from leaves, branches and flowers of infected apple, pear, and quince trees collected from Isfahan, Karaj, Khorasan, Lorestan and West Azarbaijan. Based on biochemical, physiological and nutritional properties, all of strains were confirmed as E. amylovora with similar characteristics as described previously in scientific publications. In this study, PCR as a rapid, sensitive, and highly specific method was carried out for identification of E. amylovora . Using primer pair Ea71A/B, a fragment of 187 bp was amplified in all strains of E. amylovora. Also, an expected DNA fragment of about (900-1000 bp) was produced from the isolates which were subjected to PCR reaction with specific primer pair pEA29/pEB29 corresponding to plasmid pEA29. Genetic comparison of E. amylovora strains from Esfahan and other parts of the country by rep-PCR (BOX and ERIC primer sets) did not show any significant genetic variation among the isolates. Fingerprinting analysis by NTSYS-pc program revealed that all strains were grouped in to four clusters at with similarity level of 90%. To examine the sensitivity of strains to antibiotics and copper compound, all the strains were tested against different concentration of streptomycin, oxytetracyclin and copper sulfate by disc and well diffusion method on nutrient agar and also growth reduction measurement in Nutrient broth. None of the strains were resistant to streptomycin, oxytetracyclin and copper. To examine the best way to detect E. amylovora from epiphytic phase, a polyclonal antibody raised against strain A, isolated from apple in Shahin Shahr, and its IgG was purified by Ammonium sulfate precipitation method. The specifity of Antibody and IgG was confirmed by Ouchterlony double diffusion test and indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Comparing several detection methods including Indirect ELISA, Direct PCR, Bio-PCR and Ic-PCR to detect E. amylovora from asymptomatic leaves of apple sprayed with strain A, showed a significant difference in detection capability of the methods. Although indirect ELISA was able to detect 10 4 cfu/ml, both Ic-PCR and Bio-PCR were found more sensitive with 10 -1 cfu/ml detection threshold. Since indirect ELISA, PCR and Ic-PCR are unable to differentiate viable and dead cells in epiphytic population, it seems that Bio-PCR could be a sensitive and functional technique for the detection of E. amylovora . By Using Ic-PCR method, a minimum population of E. amylovora was detected in broth culture mixed with high population of saprophytic bacteria. Also the method was efficient to detect E. amylovora from the surface of leaves of apple, 16 days after spraying with suspension of strain A.

آتشک گلابی (Fire blight) یکی از بیماری های بسیار مهّم درختان میوه دانه دار محسوب می شود که توسط باکتری Erwinia amylovora روی میزبان های مختلف خانواده گلسرخیان ایجاد می شود. علائم بیماری آتشک درختان میوه دانه دار معمولاً اوایل بهار در گل ها ظاهر می شود. گل ها علائم آب سوختگی (Water soaking) نشان داده و بعد از تغییر رنگ به قهوه ای، پژمرده شده و ریزش می کنند. علائم بیماری سپس روی برگ ها به صورت لکه های سیاه در طول رگبرگ اصلی و رگبرگ جانبی دیده می شود. چنانچه روی شاخه های آلوده میوه ای تشکیل شود، در ابتدای رشد، میوه چروکیده شده و در نهایت سیاه می شود که در مواردی با ترشح باکتری (Ooze) همراه است. طی سال های گذشته شیوع بیماری آتشک در درختان میوه دانه دار در مناطق مختلف کشور، خسارت قابل توجهی را به باغداران تحمیل کرده است. اخیراً نیز، مشاهده اولیّه درختان سیب مبتلا به آتشک در ناحیه شاهین شهر و میمه و سپس وقوع این بیماری در درختان گلابی، سیب و بِه منطقه نطنز، معلوم نمود که استان اصفهان نیز از خسارت بیماری مصون نیست و آتشک درختان میوه دانه دار در حال گسترش در باغات این منطقه می باشد. طی این پژوهش، بر اساس مشخصات مرفولوژیکی، بیماری زایی، بیوشیمیایی و ژنتیکی، عامل بیماری آتشک درختان میوه دانه دار E. amylovora شناسایی شد. بررسی های انجام شده مشخص نمود که جدایه های مورد مطالعه به لحاظ خصوصیات بیماری زایی و بیوشیمیایی مشابه یکدیگر بوده و خصوصیات آنها با مشخصات جدایه های E. amylovora گزارش شده در منابع علمی مطابقت دارد. در بررسی های ملکولی، طی واکنش CRبا استفاده از جفت آغازگراختصاصی B/EaA یک قطعه bp 187 در کلیه جدایه ها تکثیر شد. جفت آغازگر PEA29A/B نیز قادر به تکثیر یک باند DNA kb 9/0 در جدایه ها بود که توالی نوکلئوتیدی آن 99% با جدایه های گزارش شده E. amylovora از سایر مناطق دنیا شباهت داشت. بررسی تنوع ژنتیکی جدایه ها به روش rep-PCRبا استفاده از آغازگرهای Box و ERIC نشان داد که جدایه های عامل بیماری آتشک در استان اصفهان با جدایه های سایر مناطق کشور اختلاف قابل توجهی ندارد. به دلیل اینکه در کنترل بیماری آتشک از آنتی بیوتیک های استرپتومایسین و تتراسیکلین و یا ترکیبات مسی استفاده می شود، تعیین حساسیت و یا مقاومت جدایه های عامل بیماری آتشک درختان میوه دانه دار در این پژوهش مورد توجه قرارگرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که هیچکدام از جدایه ها مقاومتی به سولفات مس و آنتی بیوتیک های استرپتو مایسین و تتراسیکلین ندارند. با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی در PCR نیز، ژن های کروموزومی و پلاسمیدی مربوط به مقاو مت در برابر استرپتومایسین در جدایه ها ردیابی نشد که موید حساس بودن جدایه ها در مقابل این آنتی بیوتیک می باشد. در این پژوهش، استفاده از روش های سرلوژیکی، ملکولی و تلفیق آن ها برای ردیابی جمعیت پایین باکتری E. amylovora مورد بررسی قرارگرفت. به این منظور، ابتدا آنتی سرم اختصاصی جدایه A تهیه شد و پس از اطمینان از اختصاصی بودن آن در واکنش با جدایه های E. amylovora در آزمون نشت دو طرفه در آگار، گاماگلوبین اختصاصی آن تهیه گردید. با آزمون الایزای غیرمستقیم معلوم شد که این گاماگلوبین با جدایه های E. amylovora واکنش اختصاصی ایجاد می کند و هیچ گونه اثر متقابلی با باکتری های ساپروفیت یا باکتری های بیمارگر از جنس های دیگر ندارد. استفاده از این گاماگلوبین در آزمون های io PCR و Ic-PCR نشان داد که هر دو روش قادرند جمعیت پایینی از با کتری (در حدود 1- 10 واحد تشکیل دهنده پرگنه در میلی لیتر) را ردیابی نمایند که این میزان به روش الایزا در حدود 10 4 واحد تشکیل دهنده پرگنه در میلی لیتر برآورد شد. با روش io PCRجمعیت بسیار کم E. amylovora در اختلاط با جمعیت قابل توجهی از باکتری های ساپروفیت در شرایط آزمایشگاهی ردیابی گردید. به روش مزبور، ردیابی E. amylovora در سطح برگ های سیب، 16 روز پس از پاشش باکتری روی برگ، موفقیت آمیز بود. به این ترتیب، روش io PCRبه عنوان یک روش ساده، قابل اعتماد و حساس برای ردیابی سلول های زنده و فعال E. amylovora معرفی می شود. کلمات کلیدی : آتشک گلابی، درختان میوه دانه دار، استرپتومایسین، روش های سرولوژیکی