SUPERVISOR
احمد ریاسی (استاد مشاور) محمد حسین نصر اصفهانی (استاد راهنما) حمیدرضا رحمانی (استاد راهنما) سمیه استادحسینی (استاد مشاور)
STUDENT
Mehrdad Hodaee
مهرداد هدائی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1389
TITLE
Impact of Adenylate cyclase activator on the in vitro maturation and early embryonic development of ovine oocytes
Lower developmental capacity of the in vitro-matured oocyte is due to asynchronous between nuclear and cytoplasmic maturation. Oocytes that are artificially removed from the antral follicle resume meiosis spontaneously while the cytoplasm still has not acquired the capacity necessary to support fertilization and early embryonic development. Temporary delaying of spontaneous nuclear maturation might improve the quality of the cytoplasmic development and finally improve the developmental competence of IVM oocytes. Studies show that the cAMP plays an important role in the regulation of mammalian oocyte maturation. High concentrations of cAMP inside the oocyte lead to meiotic arrest, whereas meiosis resumption of the oocyte depended to low concentrations of the cAMP within the oocyte. In an effort to improve the developmental competence of IVM oocytes by controlling nuclear and cytoplasmic maturation have mainly concentrated on a ‘biphasic IVM’ strategy. Hence the present study was designed to evaluate the effect of adenylate cyclase activator (Forskolin) on meiotic resumption and developmental capacity of ovine immature oocytes. Ovine COCs were first used for routine IVM and stepwise pattern of nuclear maturation was evaluated at 2 h intervals. Then, immature COCs were cultured in pre-IVM medium in the presence of different concentrations of Forskolin (10, 50, 100, 200, 300, and 400) and at three important pre-IVM intervals, determined in the former experiment (6, 8 and 22 hour after pre-IVM), and the nuclear status and microtubule organizations of the oocytes were assessed. Then the effect of selected Forskolin concentration on dynamic of nuclear status during critical stage of GV to GVBD transition was assessed at 1h intervals (0 to 6 hour) during pre-IVM. Finally, to assess the effect of Forskolin on oocyte competence, treated (selected Forskolin concentration) and non-treated (control) oocytes were subjected parthenogenetic activation (PA). In this study, owing to successful application of Forskolin in GV-maintenance in cattle oocytes, we used Bovine oocytes as external control. Bovine COCs were first used for routine IVM and stepwise pattern of nuclear maturation was evaluated, then we exposed bovine COCs in pre-IVM medium with 50 and 100 µM Forskolin and oocyte meiotic status was assessed after 8 and 22 h in pre-IVM. The results revealed that By 8 h, metaphase I had occurred in most oocytes. At 16 h, most of the oocytes were at anaphase I and telophase I and at 22 h, most oocytes had reached metaphase II. No significant difference was observed in the percentages of oocytes that were maintained at the GV stage after 6, 8or 22 hours in pre maturation culture. It was observed that 300 and 400 µM concentrations of Forskolin were toxic. Therefore, based on these results concentration 50µM Forskolin was chosen. Our results show Forskolin only induces 2h delay in meiotic resumption in ovine. Cumulus expansion was not affected by Forskolin. Investigation of embryonic development via PA showed that in the control group, cleavage rate was reduced while Blastocyst rate of oocytes treated with 50 µM Forskolin was significantly lower than control group. In this study also, bovine oocytes arrested in the GV stage by 8 h of culture with 50 and 100 µM forskolin, hence forskolin only transiently blocked GV; by 22 h of culture approximately no oocytes were arrested at the immature GV stage. Keywords : In vitro maturation, Two-step culture, Forskolin, Embryonic development
انجام بلوغ آزمایشگاهی تخمک های نابالغ از فولیکول های آنترال یک تکنیک امید بخش برای درمان ناباروری می باشد. اعتقاد بر این است که کاهش شایستگی تکوین تخمک های بالغ شده در شرایط آزمایشگاهی به علت مطلوب نبودن شرایط کشت و همچنین عدم هم زمانی بین بلوغ هسته ای و بلوغ سیتوپلاسمی می باشد به این صورت که در شرایط آزمایشگاهی بلوغ هسته ای قبل از بلوغ سیتوپلاسمی اتفاق می افتد و تکمیل بلوغ هسته ای به منزله کسب شایستگی تکوینی نیست. این امکان وجود داردکه با ایجاد تاخیر در پروسه بلوغ خود به خودی، بین بلوغ هسته ای و بلوغ سیتوپلاسمی در طول کشت تخمک های نابالغ هم زمانی ایجاد شود و در پی آن شایستگی تکوین تخمک در شرایط آزمایشگاهی افزایش یابد. تحقیقات مختلف نشان داده است که cAMP نقش مهمی در تنظیم بلوغ تخمک های پستانداران و مخصوصا تخمک های جوندگان بازی می کند، به گونه ای که افزایش میزان cAMP درون تخمک سبب توقف میوز و کاهش آن از سر گیری میوز را باعث می شود. استفاده از ماده ای به نام فورسکولین که به عنوان فعال کننده آدنیلات سیکلاز شناخته می شود، موجب افزایش سطح cAMP در کل مجموعه کومولوس- تخمک (COC) و داخل تخمک میشود. هدف ما از این تحقیق افزایش شایستگی تکوین تخمک های بالغ شده گوسفندی با استفاده از سیستمIVM دو مرحله ای (شامل pre-IVM و IVM) می باشد. در این پژوهش، تخمک ها در زمان های مختلف و در طی روند بلوغ آزمایشگاهی با استفاده از رنگ آمیزی از نظر تغییرات هسته و میکروتوبول مورد بررسی قرار گرفتند، و اثر 6 غلظت مختلف از فورسکولین (10 ، 50، 100، 200، 300 و 400 میکرومول) بر توقف میوزی تخمک های گوسفندی در 3 زمان (6، 8 و 22 ساعت پس از pre-IVM) مورد مطالعه قرار گرفت. همچنین اثر سمیت فورسکولین در غلظت های بالا نسبت به گروه شاهد بررسی شد. با توجه به نتایج حاصله غلظت مناسب انتخاب و اثر آن بر روی دینامیک وضعیت هسته در فاصله های زمانی 1 ساعت (0، 1، 2، 3، 4، 5 و 6 ساعت پس از pre-IVM) ارزیابی شد، همچنین اثر غلظت فورسکولین انتخاب شده بر روی گسترش سلولهای کومولوس 22 ساعت پس از IVM برای گروه شاهد و همین زمان در پایان فاز دوم (سیستم IVM دو مرحله ای) برای گروه تیماری بررسی شد. در نهایت اثر غلظت فورسکولین انتخاب شده بر روی شایستگی تکوین تخمک ها، بررسی شد. در این مطالعه نیز از تخمک های گاوی به عنوان گروه شاهد مثبت استفاده شد و تخمک ها گاوی در زمان های مختلف و در طی روند بلوغ آزمایشگاهی با استفاده از رنگ آمیزی از نظر تغییرات هسته و میکروتوبول مورد بررسی قرار گرفتند سپس COC های گاوی در محیط pre-IVM با غلظت های 50 و 100 میکرومول فورسکولین تیمار شدند و وضعیت میوزی تخمک ها در دو بازه زمانی (8 و22 ساعت پس از pre-IVM) ارزیابی شد. زمان وقوع مراحل مختلف میوز، متافازI، آنافاز-تلوفازI و متافازII، در طی بلوغ آزمایشگاهی به ترتیب 8، 16 و 22 ساعت پس از کشت، حاصل شد. نتایج ما نشان می دهد که پیشرفت میوزی در تخمک های گوسفندی مهار نشده، و تفاوت معنی داری بین گروه های آزمایشی از لحاظ تخمک های حفظ شده در مرحلهGV وجود ندارد. همچنین افزایش غلظت فورسکولین به 300 و 400 میکرو مول، منجر به ناهنجاری یا آشفتگی وضعیت کروموزومی می شود. با توجه به نتایج حاصله و این که تفاوت معنی داری بین گروه های آزمایشی وجود ندارد، غلظت 50 میکرو مول به منظور بررسی حداکثر اثرات مهاری فورسکولین انتخاب شد. و نشان داد حداکثر اثرات مهاری تا 2 ساعت می باشد، همچنین غلظت انتخاب شده تاثیری بر گسترش سلولهای کومولوس و شایستگی تکوین نداشت. نتایج حاصله از تخمک های گاوی نشان می دهد 8 ساعت پس از pre-IVM، درصد تخمک های حفظ شده در مرحله GV در گروه تیمار بالاتر از گروه شاهد است و این تفاوت معنی دار است، اما 22 ساعت بعد از pre-IVM اکثر تخمک ها در گروه تیماری و شاهد به مرحله متافاز II پیشرفت کرده اند. واژه های کلیدی: بلوغ آزمایشگاهی، کشت دو مرحله ای، فورسکولین و شایستگی تکوین