بررسی توان تولید اجزاء پروتئینی مهارکننده آنزیم دی پپتیدیل پپتیداز (DPP-IV) توسط لاکتوباسیلوس پلانتاروم زیرگونه پلانتاروم PTCC 1896 از پروتئین های آب پنیر

STUDENT

DEGREE

YEAR

In recent years there has been a great deal of interest in nutraceuticals that have shown health benefits. At present, the nutraceutical sector is experiencing the fastest growth in the food industry. Diabetes is a disease that the body loses the ability to control blood sugar. There are many reasons that a person develops diabetes. Diabetes creates a new way of life and affects all relationships in all areas, and even affects one's eating and physical behaviors. Therefore, in recent years, finding no-side-effect methods for the treatment of this disease is one of the important goals of active researchers in this field. Bioactive peptides are dietary derived peptides that have physiological and hormonal-like effects beyond their nutritional value. Dipeptidyl peptidase (DPP-IV) inhibitory peptides have emerged as promising new oral agents for the treatment of type 2 diabetes. Recent studies on bioactive peptides have shown that dietary proteins can be natural precursors for the production of DPP-IV inhibitor peptides, and one of the highly regarded methods for producing bioactive peptides is the fermentation of protein products by Lactic acid bacteria. Therefore, this study aimed to investigate the ability of lactic acid bacteria to produce DPP-IV inhibitory peptides for the treatment of type 2 diabetes. The first step in producing such a product is to investigate the presence of trypsin enzyme or trypsin like protease (TLP) to produce bioactive peptide from proteinous substrate. For this purpose, the ability of TLP production by L . plantarum su. plantarum PTCC 1896 was investigated in three different culture media, including de Man, Rogosa and Sharpe broth (MRSB), sweet whey broth (SWB), and skimmed milk broth (SMB). Post-centrifuged supernatant was used to evaluate TLP production, and to evaluate TLP activity (mU/ml) using specific substrate N - ?-benzoyl-DL-arginine-?-nitroanilide (BAPNA). Based on the results, TLP was only produced in SMB media, whereas in the MRSB and SWB fermentation medium no activity was observed at any growth stages. Therefore, in the continuation of the study, all experiments were only performed on the TLP produced in the SMB medium. In the second part of the study, in order to produce bioactive peptides with DPP-IV inhibitory ability for their use in the treatment of type 2 diabetes, WPC hydrolysis using filtered TLP was investigated. The results showed that whey protein concentrate (WPC) non hydrolysed (negative control) no DPP-IV inhibitory activity, whereas hydrolysed WPC had a remarkable amount of DPP-IV inhibitory activity. Key words : L. plantarum su. plantarum PTCC 1896, TLP, Whey protein concentrate (WPC), Bioactive peptides, Diabetes, Dipeptidyl peptidase (DPP-IV).

در سال های اخیر توجه و علاقه ی زیادی نسبت به غذا داروها شکل گرفته است. در حال حاضر بخش غذا داروها در حوزه ی صنایع غذایی سریع ترین رشد و پیشرفت را به خود اختصاص داده است. دیابت بیماری است که بدن توانایی کنترل قند خون را از دست می دهد. دلایل بسیار زیادی وجود دارند که افراد مبتلا به دیابت می شود. دیابت باعث ایجاد یک شیوه جدید زندگی می شود و تمامی روابط فرد حتی نحوه غذا خوردن و رفتارهای فیزیکی او را تحت تأثیر قرار می دهد. بنابراین در سال های اخیر، پیدا کردن روش های بدون عوارض جانبی برای درمان این بیماری یکی از اهداف مهم پژوهشگران فعال در این زمینه می باشد. پپتیدهای زیست فعال، پپتیدهای مشتق شده ی غذایی هستند که فراتر از ارزش غذایی شان اثرات فیزیولوژیک و شبه هورمونی در بدن دارند. پپتیدهای مهارکننده آنزیم دی پپتیدیل پپتیداز (DPP-IV) بعنوان عوامل خوراکی جدید و امیدوار کننده برای درمان دیابت نوع دو پدید آمده اند. مطالعات اخیر در زمینه پپتیدهای زیست فعال نشان داد که پروتئین های رژیم غذایی می توانند بعنوان پیش سازهای طبیعی برای تولید پپتیدهای مهارکننده DPP-IV باشند، و یکی از روش های بسیار مورد توجه جهت تولید پپتیدهای زیست فعال، تخمیر محصولات پروتئینی به کمک باکتری های اسید لاکتیک است. بنابراین این مطالعه با هدف بررسی توانایی تولید پپتیدهای مهارکننده DPP-IV در اثر عملکرد باکتری های اسید لاکتیک بر روی پروتئین های آب پنیر جهت درمان دیابت نوع دو انجام گرفت. اولین قدم در تولید چنین محصولی بررسی حضور آنزیم هیدرولیز کننده پروتئین های آب پنیر به منظور تولید پپتیدهای زیست فعال است. بدین منظور توانایی تولید پروتئین شبه تریپسین (TLP) توسط باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم زیر گونه پلانتاروم PTCC 1896 در سه محیط کشت مختلف، MRS مایع، آب پنیر شیرین (Sweet whey broth) و شیر خشک (Skimmed milk broth) بازسازی شده مورد بررسی قرار گرفت. از محلول رویی، پس از سانتریفیوژ تولید TLP و فعالیت (mU/ml) آن با استفاده از سوبسترای اختصاصی N - ?- بنزوئیل- DL- ارجنین- ?- نیتروآنیلید (BAPNA) مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج بدست آمده، TLP فقط در محیط SMB (حداکثر فعالیت 38/1 میلی یونت/ میلی لیتر پس از 14 ساعت تخمیر) تولید شد، در حالی که در محیط های تخمیر MRSB و SWB هیچ فعالیتی در هیچ یک از مراحل رشد مشاهده نشد. بنابراین در ادامه مطالعه، تمام آزمایشات فقط بر روی TLP تولید شده در محیط SMB انجام شد. مطالعات بیوشیمیایی نشان داد که این آنزیم دارای وزن مولکولی 25 کیلو دالتون، دما و pH بهینه به ترتیب 39 درجه سانتی گراد و 5/7، پایداری دمایی و پایداری pH فعالیت به ترتیب 37 درجه سانتی گراد و 9-7 بود. در مرحله بعد توانایی هیدرولیز کنسانتره پروتئین آب پنیر (WPC) توسط شبه تریپسین تولیدی در شرایط آزمایشگاهی به منظور استفاده از آن در تولید اجزای پروتئینی مهارکننده DPP-IV مورد بررسی قرار گرفت. همچنین به منظور پیش بینی بهترین شرایط هیدرولیز، اپتیمم سازی بـا اسـتفاده از طرح سطح پاسخ انجام گرفت. نتایج نشان داد که روش آماری RSM روشی خوب و قابل اطمینان برای انتخاب سطوح بهینه از فاکتورهای مورد بررسی است، زیرا میزان هیدرولیزی که به واقعیت در شرایط آزمایشگاهی اندازه گیری شد با میزان هیدرولیز پیش بینی شده در RSM مطابقت داشت. همچنین نتایج نشان داد که نقطه بهینه برای هیدرولیز کنسانتره پروتئین آب پنیر توسط TLP فیلتر شده در نسبت آنزیم: سوبسترا (E:S) برابر 5:100، زمان 6/8 ساعت و دما 40 درجه سانتی گراد بود. در ادامه، توانایی هیدرولیزهای WPC بعنوان منابع طبیعی مهارکننده های DPP-IV مورد ارزیابی قرار گرفت. براساس نتایج به دست آمده، WPC هیدرولیز نشده هیچ فعالیت مهار کنندگی DPP-IV از خود نشان نداد. در مقابل، WPC هیدرولیز شده و پرمیئیت های 5 و 10 کیلو دالتون به ترتیب مقادیر IC 50 مساوی با 98/1، 19/1 و 9/0 میلی گرم/میلی لیتر داشتند. در پایان فعالیت مهار کنندگی DPP-IV توسط لاکتوباسیلوس پلانتاروم زیر گونه پلانتاروم PTCC 1896 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این باکتری مقدار قابل قبول فعالیت مهاری DPP-IV را در اختیار دارد. به طور خلاصه نتایج حاصل نشان داد که اگرچه هیدرولیزهایWPC حاصله، بعنوان بازدارنده DPP-IV به اندازه داروهای مصنوعی قوی نیستند و لیکن از آنها می توان بعنوان یک روش مکمل طبیعی در مدیریت دیابت نوع دو (کاهش عملکرد غیرفعال کردن هورمون های اینکرتین) استفاده کرد. کلمات کلیدی : لاکتوباسیلوس پلانتاروم زیر گونه پلانتاروم PTCC 1896 ، آنزیم شبه تریپسین، کنسانتره پروتئین آب پنیر، پپتیدهای زیست فعال، دیابت، آنزیم دی پپتیدیل پپتیداز.