بررسی اثر اوره و فاکتور رشد اپیدرمال بر کیفیت اسپرم و جنین های حاصل از آن و بازچرخ اسیدهای آمینه در تخمک گاو در شرایط آزمایشگاهی

STUDENT

DEGREE

YEAR

One of the crucial effective factors on economic diary farming in the dairy cattle units is the pregnancy rate, then increasing the reproduction rate is very important to raise the productivity of cattle. The high quality feed especially protein is an effective factor on pregnancy of farm animals. Recently, the researches indicate if nitrogen concentration of urea increases to 20 mg/dl, the pregnancy rate will decrease. Many researches refer to the role of growing factors in initial step of the embryo and implantation. This study aimed to examine the urea effect and growing epidermal factor on the semen (sperm), the embryos, and recycle of amine-acides in the bovine ovum. In the test 1 and first step, tunnel test was used to determine the urea concentration of semen (sperm). The purpose of this study is assessment of sperms' biotic potencial in the cows. The researcher used 3 groups in vitro, control group, 20 urea group (20 mg/dl) and 40 urea group (40 mg/dl). First, to provide the basic information about sperm quality, the sperm parameters include counting and motality were obtained from the samples. The results show that although there is not difference between control and urea 20 group, increasing urea level to 40, raise up the DNA fragmentation index significantly. Accordig to the results, urea 40 group was selected because is popular in the productive cows. In the next steps with control group (without urea), urea 40 group (40 mg/dl), growing factors of epidermal group (10ng) and urea 40 with growing factors of epidermal, sperms treat by these methods 30 minutes. After insemination using treats, total degenerated, infertile oocytes and the percent of zygots 2-8 cells, zygots 8-16 cells, blastoscystis rate and exiting from Zona (Hatching) step to total oocytes were considered. Urea and epidermal growing factor with the mentioned concentrations added to ovum medium and results were obtained afetr 3 and 5 days. The percentage of waste ovums has not significant difference between the groups. The infertile ovums' percentage was significantly decreased to other groups. 40 mg/dl urea and 10 ng epidermal growing factor do not impact on the percentage of 2-8 cells embryos to oocytes in eighth day. Epidermal growing factor and urea concentration do not effect on the rate of Zona step but when urea and epidermal growing factor added to medium simultaneous, the rate of Zona step increased significantly. In addition, 9 th day blastoscystis after expression of BAX, BCL2, and DNMT1 as apoptosis index was studied. The results show that urea and epidermal growing factor simultaneously decrease the trascription of BAX gen. However, the trascription of BCL2 gen with existence the urea and epidermal growing factor simultaneously will increase. Expression of DNMT1 gen with existence the urea and epidermal growing factor will increase significantly to other groups. In the second test, in vitro, turnover of the amine acid in the bovine ovum medium with different concentrations was considered. In this study, samples with three treatments, control (without adding the urea), group 20 (adding 20 mg/dl) and urea 40 (adding 40 mg/dl), during 24 hours and 6 repeats were studied. The analysis of turnover of amine acid conducted by HPLC device. The findings show that increasing the urea in the uvum medium, raising up the rate of turnover, usage of amine acids such as essencial amino acid to product the milk (methionine, lysine, histidine) and key amine acid to grow the uvum (glutamine, alanine, argening, leucine and tryptophan). Keywords : EGF, Urea, Esperm, Bovine Oocyte, IVF, Turnover

از مهم ترین عوامل مؤثر بر اقتصادی بودن فعالیت واحدهای پرورش گاو شیری می توان به نرخ آبستنی اشاره کرد، بنابراین بالا بردن نرخ تولیدمثلی یکی از عوامل بسیار مهم در جهت افزایش بهره وری گله است. کیفیت بالای خوراک مصرفی، به ویژه پروتئین خوراک یکی از مهم ترین عوامل تاثیر گذار بر باروری حیوانات مزرعه ای می باشد. تحقیقات چند سال گذشته نشان داده اند که هر زمان غلظت نیتروژن اوره ای خون به بیش از 20 میلی گرم در دسی لیتر برسد، باروری کاهش می یابد. پژوهش های اخیر، نشان دهنده نقش فاکتور های رشد در تکوین اولیه رویان و لانه hy;گزینی آن می باشد هدف از این پژوهش بررسی اثر اوره و فاکتور رشد اپیدرمال بر کیفیت اسپرم و جنین های حاصل از آن و همچنین باز چرخ اسیدهای آمینه در تخمک گاو بود. در آزمایش یک و در مرحله اول برای تعیین غلظت اوره، تست تانل بر روی اسپرم انجام گرفت. این پژوهش با هدف ارزیابی توان زیستی اسپرم های گاو در سه تیمار گروه کنترل، گروه اوره 20 (20 میلی گرم در دسی لیتر) و گروه اوره 40 (40 میلی گرم در دسی لیتر) در شرایط آزمایشگاهی انجام گرفت. ابتدا پارامترهای اسپرمی شامل شمارش و قابلیت تحرک بر روی نمونه ها انجام شد تا اطلاعات اولیه ای در مورد کیفیت اسپرم کسب گردد. نتایج نشان داد که هرچند اختلاف چندانی بین گروه کنترل و گروه اوره 20 نبود اما با افزایش سطح اوره به 40 میزان شکستگی DNA به طور معنی داری افزایش یافت. با توجه به این نتایج برای انجام مرحله بعدی تحقیق، گروه اوره 40، که در گاوهای پرتولید متداول تر است انتخاب شد. در مراحل بعدی آزمایش که گروه های آن شامل گروه کنترل (بدون اوره)، گروه اوره 40 (40 میلی گرم در دسی لیتر اوره) ،گروه فاکتور رشد اپیدرمال ( 10 نانوگرم ) و اوره 40 به همراه فاکتور رشد اپیدرمال بود، اسپرم ها به مدت 30 دقیققه در معرض این تیمارها قرار گرفتند. پس از انجام لقاح با استفاده از تیمارهای لقاح شده درصد کل اووسیت های از بین رفته، لقاح نیافته، تعداد زایگوت های رسیده به مرحله 8-2 سلولی، درصد زایگوت های رسیده به مرحله 16-8 سلولی، نرخ بلاستوسیست و خروج از زونا (هچینگ) نسبت به کل اووسیت ها بررسی شد. اوره و فاکتور رشد اپیدرمال با غلظت های ذکر شده به محیط بلوغ تخمک ها اضافه شد و نتایج در روز سه و پنج ثبت شد. درصد تخمک های از بین رفته در هیچ کدام از گروه ها تفاوت معنی داری با هم نداشت. درصد تخمک های لقاح نیافته در گروه کنترل در مقایسه با گروه های دیگر به طور معنی داری کمتر بود. درصد تعداد جنین های 2 تا 8 سلولی به دست آمده نسبت به کل اووسیت ها در روز هشتم تحت تاثیر غلظت 40 میلی گرم در دسی لیتر اوره و همچنین 10 نانوگرم فاکتور رشد اپیدرمال قرار نگرفت. نرخ خروج از زونا تحت تاثیر غلظت اوره و فاکتور رشد اپیدرمی قرار نگرفت ولی وقتی اوره و فاکتور رشد اپیدرمال با هم به محیط کشت اضافه شدند نرخ خروج از زونا با اختلاف معنی داری کاهش یافت. در ادامه همین آزمایش در بلاستوسیست های به دست آمده در روز نهم پس از لقاح بیان ژن های BAX، BCL2 و DNMT1 به عنوان نشانگرهایی برای شناسایی آپوپتوز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این مرحله از آزمایش نشان داد که فاکتور رشد اپیدرمال و اوره به طور همزمان میزان بیان رونوشت ژن BAX را کاهش می دهند. اما میزان رونوشت ژن BCL2 در حضور همزمان اوره و فاکتور رشد اپیدرمال افزایش یافت. همچنین میزان بیان ژن DNMT1 در حضور همزمان اوره و فاکتور رشد اپیدرمال نسبت به سایر گروه ها به طور معنی داری افزایش می یابد. در آزمایش دوم از این طرح، ترن آور اسید آمینه ای در محیط بلوغ تخمک گاو در معرض غلظت های مختلف اوره قرار گرفته در شرایط آزمایشگاهی بررسی شد. در این تحقیق نمونه ها در 3 تیمار، کنترل (بدون افزودن اوره)، و گروه 20 (افزودن 20 میلی گرم بر دسی لیتر) و اوره 40 ( افزودن 40 میلی گرم بر دسی لیتر به مدت 24 ساعت و در 6 تکرار بررسی شدند. تجزیه و تحلیل ترن آور اسیدآمینه ای با استفاده از دستگاه HPLC انجام شد. نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان داد که با افزایش میزان اوره در محیط بلوغ تخمک میزان باز چرخ (ترن آور) و مصرف کلی اسید های آمینه، همچون اسید های آمینه ضروری در تولید شیر (متیونین، لیزین و هیستیدین) و اسید های آمینه کلیدی برای رشد و توسعه تخمک (گلوتامین،آلانین،، آرژنین، لوسین و تریپتوفان) بالا می رود. کلمات کلیدی: فاکتور رشد اپیدرمال، اوره، اسپرم، تخمک گاو، لقاح برون تنی، بازچرخ