SUPERVISOR
صادق جلالی (استاد راهنما) امیر مساح (استاد راهنما) مسعود بهار (استاد مشاور)
STUDENT
Maryam Ghorbanian
مریم قربانیان کردآبادی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Master of Science (MSc)
YEAR
1395
TITLE
Molecular identification and distribution of Plum pox virus and Tomato ringspot virus in stone fruit trees in Isfahan province
Iran with various climatic conditions is one of the most important countries in the cultivation of fruit trees especially stone fruits in the world. Many viruses have been reported on stone fruits around the world so far. Plum pox virus (PPV) and Tomato ringspot virus (ToRSV) are two major viruses in stone fruits. PPV is a member of the Potyvirus genus and Potyviridae family with a positive-sense single-stranded RNA genome. The virus causes Sharka disease, one of the most destructive diseases of stone fruits, worldwide. PPV is transmitted by aphid in a non-persistent manner and vegetative organs. Tomato ringspot virus (ToRSV) is a member of the Nepovirus genus and Secoviridae family with isometric particles and two positive-sense single-stranded RNAs as genome. The virus has wide host range mainly on woody and ornamental plants. ToRSV is transmitted by nematode, seeds, pollen and vegetative organs. There is no information on the presence of PPV and ToRSV on stone fruits in Isfahan province. In this research to detect PPV and ToRSV a survey was carried out during 2017-2019. Symptomless leaf samples and the leaf samples showing viral symptoms were collected from stone fruits orchards in Isfahan province. Total RNA was extracted from leaf samples and tested by RT-PCR using specific primer pairs for PPV (P3D/P4B and P1/P2) and ToRSV (ToRSV-D1/ToRSV-U1 and Oligo1n/Oligo2n). Some collected samples were tested using double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) using a commercial polyclonal antibody against PPV. In RT-PCR unexpected fragment sizes of 400 bp and 500 bp were amplified in one and two of the 169 samples using ToRSV-D1/ToRSV-U1 and Oligo1n/Oligo2n primer pairs, respectively. The amplicons were sequenced. No homology was found in BLAST search between sequenced samples and ToRSV isolates available at GenBank. In DAS-ELISA eight of the 55 samples collected from Khansar were tested positive. The expected PCR product of 243 bp was amplified in five of the 313 samples in RT-PCR using P1/P2 primer pair. No expected PCR product was amplified in tested samples using P3D/P4B primer pair. The amplicons were weak and despite changing the time and temperature of annealing phase and MgCl 2 concentration in PCR, no change was found in intensity of amplified bands. The PCR products were extracted from gel and sequenced. Analysis of sequenced samples by Chromas ver. 2.6.4 showed low-quality of sequences so their BLAST search results are unreliable. In this study ToRSV was not detected on stone fruits in Isfahan province, but based on ELISA and RT-PCR results PPV probably exist in Isfahan province on stone fruits, which is required to confirm by sequencing of amplified bands. Due to the serological relationship between potyviruses, the probability of presence of a virus close to PPV should be considered in Isfahan province. Keywords: Stone fruits, Plum pox virus, Tomato ring spot virus,ELISA, RT-PCR
ایرن به دلیل داشتن شرایط اقلیمی متنوع یکی از کشور های مهم در کشت وکار انواع درختان میوه به ویژه هسته دارها می باشد. تاکنون ویروس های متعددی از هسته دارها در سراسر دنیا گزارش شده است. ویروس های آبله آلو Plum pox virus (PPV) و لکه حلقوی گوجه فرنگی Tomato ringspot virus (ToRSV) از ویروس های مهم هسته دارها محسوب می شوند. ویروس آبله آلو از خانواده Potyviridae و جنس Potyvirus دارای گسترش جهانی است و عامل بیماری شارکا به عنوان یکی از مخربترین بیماری هسته دار ها می باشد. این ویروس دارای ژنوم آر. ان. ا. تک لا با قطبیت مثبت است و توسط شته با رابطه ناپایا و اندام های رویشی تکثیری منتقل می شود. ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی از خانواده Secoiviridae و جنس Nepovirus دارای دامنه میزبانی بسیار وسیع است و در طبیعت بیشتر بر روی گیاهان چوبی و زینتی دیده شده است. این ویروس توسط نماتد، بذر، دانه گرده و اندام های رویشی تکثیری منتقل می شود. تاکنون گزارشی از این دو ویروس در استان اصفهان وجود ندارد. به منظور ردیابی این دو ویروس در استان اصفهان نمونه های برگی دارای علایم ویروسی از نقاط مختلف استان اصفهان جمع آوری گردید. از برگ های جمع آوری شده با استفاده از روش لیتیم کلراید، Total RNA استخراج شد و از جفت آغازگر های P3D/P4B، P1/P2 و TORSV-D1/TORSV-U1، Oligo1n/Oligo2n به ترتیب به منظور ردیابی ویروس آبله آلو و ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی در آزمون RT-PCR استفاده شدند. همچنین ردیابی ویروس آبله آلو در تعدادی از نمونه ها با استفاده از روش داس-الیزا DAS-ELISA انجام شد. در 169 نمونه بررسی شده با جفت آغازگر TORSV-D1/TORSV-U1 ToRSV تنها در یک نمونه باند bp 400 و در دو نمونه نیز با جفت آغازگر Oligo1n/Oligo2n باند bp 500 تکثیر شدند که هیچکدام باند های مورد انتظار نبودند. باند های تکثیر شده تعیین توالی شدند ولی هیچکدام با توالی ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی موجود در بانک ژن در آزمون بلاست همولوژی نشان ندادند. در آزمون الیزا از 55 نمونه جمع آوری شده از خوانسار و نطنز، هشت نمونه از خوانسار در مقایسه با کنترل مثبت، آلوده به ویروس PPV تشخیص داده شدند. از 313 نمونه که با جفت آغازگر های اختصاصی PPV در آزمون RT-PCR مورد بررسی قرار گرفتند، تنها در پنج نمونه باند مورد انتظار bp 243 با آغازگرهای P1/P2 تکثیر شد ولی با استفاده از آغازگرهای P3D/P4B در هیچکدام از نمونه ها باندی تکثیر نگردید. با توجه به ضعیف بودن باند های تکثیر شده و به منظور بهینه سازی PCR، دما و زمان مرحله اتصال و میزان MgCl 2 تغییر داده شد ولی هیچکدام تاثیری چندانی در شدت باند مورد نظر نداشتند. باند های مورد نظر از ژل استخراج و برای توالی یابی ارسال شدند. بررسی توالی ها با استفاده از نرم افزارver. 2.6.4 Chroms نشان دهنده پایین بودن کیفیت آن ها بود، به همین دلیل نتایج حاصل از بلاست آن ها چندان قابل اعتماد نمی باشد. بر اساس نتایج آزمون الیزا و RT-PCR می توان گفت که ویروس ToRSV در این تحقیق بر روی هسته دارها در استان اصفهان تشخیص داده نشد ولی احتمالا ویروس PPV در استان اصفهان بر روی هسته دار ها وجود دارد که برای تایید آن لازم است تا باند های تکثیر شده مجددا تعیین توالی شوند. البته به دلیل وجود رابطه سرولوژیک بین پوتی ویروس ها ی مختلف احتمال وجود یک ویروس نزدیک به PPV را در استان اصفهان نباید از نظر دور داشت. کلمات کلیدی: درختان میوه هسته دار، ویروس آبله آلو، ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی، الیزا، RT-PCR