تاثیر آگونیست Sonic hedgehog (پورمورفامین) در روند بلوغ و تغییرات اپی-ژنتیک اووسیت های گوسفندی بالغ شده در محیط آزمایشگاهی

STUDENT

DEGREE

YEAR

Some of the small molecules such as Purmorphamine play an important role in the Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway. Purmorphamine is an agonist of SHH, which plays a critical role in the regulation activity of receptors, transcription factors and also can be used to confirm the Sonic Hedgehog pathway. In this study, effect of Purmorphamine on oocyte maturation and epigenetic modification of in vitro matured sheep oocytes were considered. Ovaries were obtained from local abattoir and cumulus-oocyte complexes cultured in the medium containing various concentrations of purmorphamine (250 and 500ng) plus a control without purmorphaminel. After 24h maturation, oocytes striped from cumulus cells and stained with Hoechst and cell tracker blue for assessment of nuclear and cytoplasmic maturation respectively, fluorescent microscope was used for photograph, taken digital images analyzed by Image-J software. For fertilization, 22 h after maturing the oocytes, they were transferred to fertilization medium and co-incubated with sperm for 18 h. Two cell embryos were used for RNA extraction and total RNA for Real Time PCR. The records were analyzed by REST software. Developmental competence oocyte examined using artificial activation, cleavage and blastocyst rate measured on D3 and D8 post activation respectively. The results showed that 250ng of Purmorphamine induced nuclear maturation and about 81 percent of oocyte showed meiosis II stage, but not significantly different from the control group (p 0.05). Based on statistical analysis 500 ng purmorphamine reduced expression PTC but SMO and GLI significantly increase (p 0.05). Furthermore, it was observed that the expression of Histone deacetylase 1-3 was reduced. Acetylation of histone H4 lysines 12 was significantly higher in 500 ng Purmorphamine. Besides, the results showed that in the presence of purmorphamine, embryo development was significantly increased. In conclusion, purmorphamine induces cytoplasmic maturation of oocyte and can be used to confirm the Sonic Hedgehog pathway. Keywords : Nuclear Mturation, cytoplasmic Maturation, Sheep Oocyte,Purmorphamine

برخی فاکتور های رشد و مولکول های کوچک نقش مهمی در مسیر سیگنالی سونیک هدجیهاگ (SHH) دارند. از جمله این مولکول های کوچک می توان به پورمورفامین اشاره کرد که ترکیب آگونیست مولکول سونیک هدجیهاگ بوده که نقش مهمی در تنظیم فعالیت گیرنده ها و عوامل رونویسی دارد. در این مطالعه تاثیرآگونیست پورمورفامین در روند بلوغ تخمک بالغ شده گوسفند در آزمایشگاه و همچنین تاثیر اپی ژنتیک این آگونیست بر روند بلوغ تخمک مورد ارزیابی قرار داده شد. پس از جمع آوری نمونه های تخمدان گوسفندی از کشتارگاه، مجموعه کومولوس- اووسیت در محیط حاوی غلظت های 250 و 500 نانو گرم پورمورفامین کشت داده شد. بعد از 22 ساعت توسط آنزیم هیالورونیداز سلول های کومولوس از تخمک جدا شد و از رنگ آمیزی هوخست و سل تراکر بلو جهت ارزیابی بلوغ هسته ای و سیتوپلاسمی استفاده گردید. سپس توسط میکروسکوپ فلورسنت عکس برداری انجام شد. جهت تجزیه آماری از نرم افزار Image j استفاده شد. 22 ساعت بعد از کشت تخمک ها در محیط IVM، تخمک های بالغ شده در مجاورت با اسپرم های گوسفند قرار داده شد تا لقاح صورت گیرد. 48 ساعت بعد با استخراج RNA از جنین دو سلولی از تکنیک Real Time PCR و نرم افزار REST برای تعیین بیان ژن های PTC1، SMO،GLI1 ،Hdac1 ، Hdac2 و Hdac3 استفاده گردید. جهت بررسی میزان کلیواژ جنین های پارتنوژنژ، 22 ساعت بعد از بلوغ، تخمک ها وارد مرحله فعال سازی شد و تا مرحله بلاستوسیست پیش رفت. نتایج بدست آمده از غلظت 250 نانوگرم پورمورفامین در محیط بلوغ تخمک نسبت به گروه کنترل نشان داد 81 درصد از تخمک ها توانسته بودند تقسیم سلولی را تا متافاز میوز II ادامه دهند اگرچه این افزایش از نظر آماری معنی دار نبود. در غلظت 500 نانوگرم پورمورفامین میزان بیان ژن های PTC1 کاهش داشت در حالیکه بیان ژن های MOو GLI1 بطور معنی داری افزایش پیدا کرد (05/0 p ). ضمنا مشاهده شد که در این غلظت بیان ژن های ژن هایHdac1 ، Hdac2 وHdac3 کاهش یافت. در ارزیابی میزان استیلاسیونH4K12 مشاهده گردید که در غلظت 500 نانوگرم پورمورفامین بیشترین میزان استیلاسیون رخ می دهد. علاوه بر این مشاهده شد در حضور پورمورفامین تعداد جنین های پارتنوژنز افزایش پیدا نمود. در این مطالعه استفاده از پورمورفامین تاثیر قابل توجه ای بر میزان بلوغ هسته ای تخمک نداشت. در مقابل پورمورفامین میزان بلوغ سیتوپلاسمی را افزایش داد. بر این اساس می توان چنین نتیجه گیری نمود که پورمورفامین برای بهبود بلوغ سیتوپلاسمی تخمک می توان مفید باشد.