استفاده از برخی ژن های کلروپلاستی دخیل در فتوسنتز و بارکدهای گیاهی برای تجزیه و تحلیل روابط فیلوژنی انار

STUDENT

DEGREE

YEAR

Pomegranate ( Punica granatum L.) is one of the oldest and most important horticultural plants in Iran. Since, Iran seems to be the origin of pomegranate, precise detection of genetic relationships among cultivars using molecular DNA markers is necessary to improve future breeding programs. Nowadays, different molecular markers have been used to determine the genetic diversity among some pomegranate cultivars such as RAPD, AFLP and SSR. Notwithstanding high morphological diversity among the cultivars, low level of polymorphism detected using these methods, which maybe attribute to the effects of climate conditions, posttranscriptional modifications and cytoplasm genes on morphological traits. Chloroplast DNA has been used extensively to analyze plant phylogenies at different taxonomic levels because of its size, organization and sequence conservation, so study of pomegranate chloroplast genome can be used to reveal phylogenetic relationships of this plant with others. Therefore, in the present research we used two chloroplast region named petA-psaJ ( petA, J, L ,F, E, petL, petG, tRNA pro , tRNA trp , psaJ ) and trnC-trnD (petN, tRNA Asp , M ( to investigate the genetic diversity of pomegranate. In addition we used four DNA barcodes ( A-trnH, ITS, rbcL, matK ) in order to study intergeneric relationships of pomegranate and also intra and inter species variation of Myrtaceae, Punicaceae and Lythraceae families. Chloroplast DNAs were extracted from the wild, cultivated and ornamental pomegranate genotypes and a wild type of myrtle ( Myrtus communis L., as the outgroup data of Myrtaceae). These genes were amplified using designed primer pairs and then sequenced. Analysis of E-petL in petA-psaJ revealed 1300 nucleotide with 4.98% genetic diversity among studied genotypes. Calculating the average of K2P (0.03), P-distance (0.028) and Pairwise distance (0.03) indicated relatively higher diversity compared with other parts of this region. PetN in trnC-trnD region has 95 nucleotide and 1.03% gene diversity. TrnC-trnD region had low diversity in compare to petA-psaJ region. Therefore, despite other studies in other plants, this region had a low potential to evaluate diversity among pomegranate cultivars. Results of plant barcodes analysis showed that two region named ITS ( =?0.012676, Coalescent depth=0.017417) and A-trnH (=?0.00524, Coalescent depth=0.003526) can be used as complementary barcodes in Myrtaceae family and ITS region (=?0.013953, Coalescent depth=0.026418) can be used for phylogenetic studies of Lythraceae. In contrast, results showed that A-trnH (=? 0.0165) provides the highest rates followed by ITS (=? 0.006) in Punicaceae family, probably complementary use of them can be solved justify; LINE-HEIGHT: 15pt; MARGIN: 0in 0in 10pt; mso-line-height-rule: exactly" Keywords: Pomegranate, Chloroplast, petA-psaJ , trnC-trnD , matK , ITS , A-trnH , rbcL .

انار ( Punica granatum L.) یکی از قدیمی‌ترین و مهمترین گیاهان باغی در ایران است. با توجه به اینکه، ایران یکی از مراکز پیدایش و تنوع انار است، به کار گیری نشانگرها و بارکدهای مناسب می تواند نقش بسیار چشمگیری در ردیابی این تنوع و مدیریت حفظ ژرم پلاسم انار داشته باشد. در اغلب مطالعات صورت گرفته با استفاده از نشانگرهای مولکولی مختلف مانند RAPD، AFLP و SSR در انار، چند شکلی پایینی علیرغم تنوع مورفولوژیک مشاهده شده است. دلیل عدم همبستگی تنوع مورفولوژیک و مولکولی را به شرایط اقلیمی مختلف، تغییرات پس از نسخه براری و ژن های سیتوپلاسمی مرتبط دانسته اند که یکی از عوامل سیتوپلاسمی در گیاهان کلروپلاست است. از طرفی به دلیل حفاظت شدگی ژنوم کلروپلاست و مطالعات اندک صورت گرفته در این زمینه، بررسی ژنوم کلروپلاست انار می تواند روابط فیلوژنی این گیاه با سایر گیاهان را آشکار سازد. بدین منظور در پژوهش حاضر از دو ناحیه ی کلروپلاستی petA-psaJ (شامل ژن های petA ، J ، L ، F ، E ، petL ، petG ، tRNA pro ، tRNA trp و psaJ ) و trnC-trnD (شامل ژن های petN, tRNA Asp و M ) به منظور یافتن ناحیه ی مناسب برای بررسی تنوع بین ارقام انار استفاده گردید. علاوه بر این چهار بارکد ( A-trnH ، ITS ، rbcL و matK ) در بررسی تنوع درون و برون گونه ای سه خانواده ی Myrtaceae ،Punicaceae، Lythraceae و همچنین مقایسه ی نتایج توالی سه خانواده مذکور با هدف تعیین موقعیت انار در سیستم رده بندی گیاهی، استفاده شد. DNA کلروپلاستی از برگ های انار وحشی، اهلی ، زینتی و گیاه "مورد" (به عنوان داده hy;ی خارج گروهی از خانواده ی Myrtaceae) استخراج گردید و ژن های مورد نظر توسط آغازگرهای اختصاصی (طراحی شده بر اساس توالی DNA همردیف شده با سایر گیاهان)، تکثیر و توالی یابی شدند. نتایج حاصل از بررسی بخش بین ژنی E-petL در ناحیه ی etA-psaJ حاکی از وجود 1300 نوکلئوتید با در صد تنوع %98/4 در بین ژنوتیپ های مورد مطالعه بود. محاسبه ی میانگین K2P(03/0)، میانگین P-distance (028/0) و میانگین airwise distance(03/0) تنوع نسبتا بالاتری را در مقایسه با سایر بخش های این ناحیه نشان داد. بخش petN در ناحیه trnC-trnD ، دارای 95 نوکلئوتید و در صد تنوع %03/1 بود. ناحیه trnC-trnD در مقایسه با petA-psaJ تنوع پایینی داشت، بنابراین بر خلاف مطالعات سایرین که از ناحیه ی trnC-trnD در بررسی روابط فیلوژنتیک سایر گیاهان استفاده کرده اند، نتایج تحقیق حاضر بر توانایی پایین آن در بررسی تنوع بین ارقام انار دلالت دارد. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل بارکدهای گیاهی نشان داد که در خانواده یMyrtaceae می توان از دو ناحیه ی ITS (012676/0=?، 017417/0= Coalescent depth) و A-trnH (00524/0=?، 003526/0=Coalescent depth) به طور مکمل و در رابطه با خانواده ی Lythraceae از ناحیه ی ITS (013953/0=?، 026418/0=Coalescent depth) برای مطالعات فیلوژنی استفاده کرد. بر خلاف خانواده hy;ی Myrtaceae، در خانواده ی Punicaceae بیشترین میزان تنوع مربوط به ناحیه ی A-trnH (0165/0=?) و پس از آن ناحیه ی ITS (006/0=?) بود که احتمالا استفاده ی مکمل آن دو می تواند مشکل طبقه بندی در سطح گونه این خانواده را مرتفع سازد. با توجه به تحقیق موجود، دو ناحیه E-petL و A-trnH دارای اطلاعات فیلوژنتیک کافی برای تعیین روابط درون گونه ای انار هستند. بر اساس درخت های فیلوژنی حاصل از بارکدهای گیاهی، انار در فاصله ی کمتری از خانواده ی Lythraceae نسبت به Myrtaceae قرار گرفت. کلمات کلیدی : انار، کلروپلاست، petA-psaJ ، trnC-trnD ، matK ، ITS ، A-trnH ، rbcL .