SUPERVISOR
مهدیه غلامی (استاد مشاور) مهدی زارعی (استاد مشاور) بهرام بانی نسب (استاد راهنما) حسین شریعتمداری (استاد مشاور) مجید طالبی (استاد راهنما)
STUDENT
Sareh Rahimi
ساره رحیمی
FACULTY - DEPARTMENT
دانشکده کشاورزی
DEGREE
Doctor of Philosophy (PhD)
YEAR
1394
TITLE
Physiological and biochemical responses, and some genes expression related to iron uptake in quince seedlings induced by using arbuscular mycorrhizal and growth-promoting rhizobacteria
Recently, it appears that the utilization of some soil microorganisms such as arbuscular mycorrhizal (AM) fungi and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) as an environmentally-friendly and sustainable strategy, as an alternative to current agricultural practices, can play an important role in preventing Fe-deficiency. To the best of our knowledge, there are no published reports concerning the effects of AM fungi and PGPR on Fe acquisition in quince seedlings under Fe deficiency condition. Therefore, this study was designed in two separate experiments to investigate the potential of AM fungi and PGPR to improve quince seedling Fe content and to gain an understanding of not only the physiological and biochemical mechanisms facilitating Fe uptake, but also the genes, under direct Fe-deficiency (The first experiment) and indirect Fe deficiency conditions (The second experiment). The first experiment was divided into two parts. The first part was arranged as a factorial experiment with two factors, including AM fungi inoculation treatments (non-AM, Funneliformis mosseae , Rhizophagus intraradices and combination of both fungi), and PGPRinoculation regimes ( Pseudomonas fluorescens , Microcuccuce yunnanensis and combination of both PGPR) as the first main factor and two Fe levels (50 µM representing Fe-sufficiency and 5 µM as Fe-deficiency) as the second factor. Theecondartoftheexperiment,which evaluated the role of AM fungi and PGPR on the expression of genes, was included AM fungi and PGPR treatments, applied separately, and two Fe levels (50 µM and 5 µM). For expression of genes, lateral roots were sampled at 0, 2, and 7 days after the start of Fe-deficiency treatments. The second experiment was arranged as a factorial experiment with two factors. The first factor was similar to the first experiment and the second factor was included four levels of sodium bicarbonate (0, 5, 10, and 15 mM NaHCO 3 ) with pH 5.5, 6.5, 7.5, and 7.8, respectively. The results showed that Fe-deficiency increased root colonization (The first experiment), but increasing the concentration of sodium bicarbonate in the nutrient solution decreased root colonization (The second experiment). In both experiments, the percentage of root colonization was significantly higher in seedlings inoculated with R . intraradices than in those inoculated with F. mosseae . Under both direct and indirect Fe deficiency, the vegetative traits, leaf chlorophyll and carotenoids content, chlorophyll fluorescence, soluble carbohydrates content, and leaf antioxidant enzyme significantly reduced compared to the Fe-sufficiency condition, whereas seedlings treated with AM and PGPR showed less decrease in all measured parameters. The leaf hydrogen peroxide and malondialdehyde content increased under both Fe deficiency conditions compared to the Fe-sufficiency. However, quince seedlings treated with AM and PGPR had a significantly lower leaf hydrogen peroxide and malondialdehyde content than that of non-treated plants. Under all Fe deficiency conditions, R. intraradices , both PGPR treatments especially M. yunnanensis , and the combination of two PGPR increased activity of root ferric chelate reductase and phenylalanine ammonia-lyase as well as total root phenolic compounds in comparison with non-treated plants. In AM and PGPR treated plants, HA 7 gene expression was found correlated with root growth characteristics. In addition, the AM and PGPR treatments significantly increased the expression of PAL 1 , FRO 2 , and CS 1 genes compared with non-treated plants under Fe deficiency condition, in parallel with the increase in the phenylalanine ammonia-lyase and root ferric chelate reductase activities; and citric acid accumulation. In both experiments, in AM and PGPR treated plants, root and leaf Fe concentrations were significantly higher than the non-treated plants. The overexpression of Fe traorter ( IRT 1 ) gene in AM and PGPR treated plants compared to the non-treated Overall, the results showed that quince seedlings are not able to activate mechanisms to overcome Fe deficiency. In contrast, AM and PGPR treatments especially, R. intraradices , M. yunnanensis and the combination of both PGPR played a key role in improving Fe deficiency by influencing physiological, biochemical, and molecular responses. Key Words Antioxidant enzymes, Beneficial microorganisms, Bio-stimulants, Ferric chelate reductase, Phenolic compounds, Phenylalanine ammonia-lyase, Sodium bicarbonate, Fe deficiency
امروزه استفاده از ریزموجودات مفید خاکزی از جمله قارچریشهها و باکتریهای ریزوسفری محرک رشد گیاه به عنوان یکی از ابزارهای امیدوارکننده و دوستدار طبیعت در زمینه جذب آهن پیشنهاد شده است. تاکنون پژوهشی در رابطه با نقش این ریزموجودات در بهبود تحمل درختان بِه به کمبود آهن صورت نگرفته است. از اینرو پژوهش حاضر در قالب دو آزمایش مجزا به منظور بررسی اثر قارچریشهها و باکتریهای محرک رشد بر واکنش پایه بذری بِه رقم اصفهان به کمبود مستقیم آهن (آزمایش اول) و کمبود نسبی آهن ناشی از بیکربنات (آزمایش دوم) انجام شد. آزمایش اول به دو بخش تقسیم شد که بخش اول به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. فاکتور اول شامل تیمار قارچریشهها ( Rhizophagus intraradice s ، Funneliformis mosseae و ترکیب دو گونه) و باکتریهای محرک رشد ( Pseudomonas fluorescens ، Microccucuce yunnanensis و ترکیب دو گونه) و فاکتور دوم شامل دو سطح آهن (50 میکرومولار به عنوان حد بهینه و پنج میکرومولار به عنوان کمبود آهن) بود. بخش دوم این آزمایش که با هدف بررسی نقش قارچریشهها و باکتریهای ریزوسفری محرک رشد گیاه بر بیان برخی ژن های مرتبط با جذب آهن صورت گرفت شامل تیمارهای قارچریشه و باکتری به صورت مجزا و دو سطح آهن (50 و 5 میکرومولار) بود که در سه مرحله زمانی (قبل از اعمال تیمار کمبود آهن، دو و هفت روز پس از آن) انجام شد. آزمایش دوم نیز به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. فاکتور اول شامل قارچریشهها و باکتریهای محرک رشد مشابه با آزمایش اول و فاکتور دوم شامل غلظتهای 0، 5، 10 و 15 میلی مولار بیکربنات سدیم بود که به ترتیب دارای pH 5/5، 5/6، 5/7 و 8/7 بودند. نتایج نشان داد آلودگی ریشه با کاهش غلظت آهن محلول غذایی به صورت معنیداری افزایش (آزمایش اول) ولی با افزایش غلظت بیکربنات سدیم محلول غذایی (آزمایش دوم) کاهش یافت. بیشترین درصد آلودگی در هر دو آزمایش نیز مربوط به قارچریشه R. intraradices بود. در هر دو شرایط کمبود مستقیم و نسبی آهن صفات رویشی، میزان کلروفیل و کارتنوئیدها، Fv/Fm، کربوهیدراتهای محلول و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی برگ دانهالهای شاهد (تلقیحنشده با قارچریشه و یا باکتری) در مقایسه با تیمارهای قارچریشه و باکتری (تلقیحشده) کاهش بیشتری نشان دادند. تحت هر دو شرایط کمبود آهن افزایش میزان پراکسید هیدروژن و مالون دیآلدهید برگ در تیمار شاهد نسبت به دانهالهای تلقیحشده به صورت معنیداری بیشتر بود. در هر دو حالت کمبود مستقیم و نسبی آهن، افزایش فعالیت آنزیمهای فریک کلات ردوکتاز، فنیل آلانین آمونیالیاز و تجمع ترکیبات فنلی کل ریشه در تیمار R. intraradices و تیمارهای باکتری به ویژه M. yunnanensis و ترکیب دو گونه باکتری در مقایسه با گیاهان شاهد مشاهده شد. نتایج بررسی بیان ژنها نیز حاکی از وجود همبستگی معنیدار بین سطح بیان ژن HA7 در تیمارهای قارچریشه و باکتری با ویژگیهای رشدی ریشه بود. علاوهبر این افزایش سطح بیان ژنهای PAL1 ، FRO2 و CS1 تحت شرایط کمبود آهن در تیمارهای قارچریشه و باکتری به موازات افزایش فعالیت آنزیمهای فنیل آلانین آمونیالیاز، فریک کلات ردوکتاز و نیز تجمع اسید سیتریک بود. در هر دو آزمایش محتوای آهن ریشه و برگ در تیمارهای قارچریشه و باکتری به صورت معنیداری بیشتر از تیمار شاهد بود. از آنجاییکه در آزمایش اول افزایش معنیدار در بیان ژن انتقالدهنده آهن ( IRT1 ) تحت تأثیر تیمارهای قارچ و باکتری در مقایسه با شاهد رخ داد میتوان به نقش احتمالی این ریزموجودات در انتقال آهن در شرایط کمبود اشاره نمود. در مجموع نتایج نشان داد که دانهالهای بِه از توانایی بسیار اندکی جهت فعالسازی مکانیسمهای تحمل به شرایط کمبود آهن برخوردار میباشند. در مقابل تیمارهای قارچریشه و باکتری با تحت تأثیر قرار دادن پاسخهای فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی دانهالها نقش کلیدی در کاهش تنش کمبود آهن داشتند. به طورکلی در این پژوهش کاربرد قارچریشه R. intraradices ، باکتری M . yunnanensis و نیز ترکیب هر دو گونه باکتری به عنوان برترین تیمارها در بهبود جذب آهن توسط ریشه دانهال به شناخته شدند. کلمات کلیدی: آنزیمهای آنتیاکسیدانی، فنیل آلانین آمونیالیاز، ترکیبات فنلی، فریککلاتردوکتاز، بیکربنات سدیم، ریزموجودات مفید، محرکهای زیستی، کمبود آهن